董　曦，孫桂波，羅　云，孫曉波，陳素紅

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州　325035;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193)

?

異鼠李素對(duì)H2O2引起的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究

董曦1，孫桂波2，羅云2，孫曉波2，陳素紅1

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193)

摘要:目的探討異鼠李素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法用MTT實(shí)驗(yàn)確定異鼠李素的心肌細(xì)胞毒作用濃度，以及抗H2O2氧化應(yīng)激損傷的最佳作用濃度。將實(shí)驗(yàn)組分為正常組、模型組、治療組、單給藥組。治療組、單給藥組均用最佳濃度的異鼠李素預(yù)孵育12 h，模型組、治療組在預(yù)孵育結(jié)束后用300 μmol·L(－1)H2O2作用4 h，模擬心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例、ROS產(chǎn)生等指標(biāo)，利用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位去極化，利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)抗氧化酶與氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)量，利用Western blot檢測(cè)線粒體凋亡信號(hào)通路與Nrf2/ARE信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，單給藥組心肌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例，ROS產(chǎn)生，線粒體膜電位去極化，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)，抗氧化酶與氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)量差異均無顯著性(P＞0.05) ;與模型組相比，治療組心肌細(xì)胞凋亡比例明顯降低(P＜0.01)，ROS產(chǎn)生明顯降低(P＜0.05)，線粒體膜電位去極化明顯改善(P＜0.01)，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3、Bax表達(dá)明顯降低(P ＜0.01)，Bcl-2表達(dá)增加(P＜0.01)，抗氧化酶表達(dá)增加(P ＜0.01)，氧化產(chǎn)物MDA表達(dá)降低(P＜0.01) ;心肌細(xì)胞中Nrf2核轉(zhuǎn)位與HO-1表達(dá)均隨著異鼠李素預(yù)孵育時(shí)間的延長而增加。結(jié)論異鼠李素能夠保護(hù)H2O2引起的心肌細(xì)胞損傷。其機(jī)制為影響線粒體凋亡通路以及激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗氧化、抗凋亡功能。

關(guān)鍵詞:異鼠李素;心肌細(xì)胞;氧化應(yīng)激;凋亡;抗氧化;動(dòng)脈粥樣硬化

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。隨著生活方式的改變，肥胖和吸煙人群的增加，高血壓病、糖尿病、高脂血癥發(fā)病率的增加，冠心病發(fā)病率不斷增高，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注于冠心病的發(fā)病機(jī)制研究。氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是重要的發(fā)病機(jī)制之一。氧化應(yīng)激損傷主要來自于缺血部位的心肌細(xì)胞在再灌注過程中(急性)，或長期低氧條件下(慢性)產(chǎn)生的過量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。這些ROS會(huì)攻擊心肌細(xì)胞的脂質(zhì)、DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子，使已經(jīng)損傷的心肌細(xì)胞情況更加惡化［1］。Nrf2/ARE信號(hào)通路是人體內(nèi)重要的抗氧化通路，調(diào)控著細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力。Nrf2/ARE信號(hào)通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的二相抗氧化酶來清除多余的ROS，保持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，并減輕ROS對(duì)細(xì)胞的損傷［2］。有研究表明在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的治療中Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮著重要的作用［3］。

異鼠李素(isorhamnetin，ISO)屬于黃酮類化合物，并廣泛存在于植物界中。其具有較好的抗腫瘤、降血脂、降血壓、抗氧化，以及擴(kuò)張冠脈等多種藥理作用，在心血管系統(tǒng)疾病防治中具有廣泛的應(yīng)用前景［4］。然而，目前關(guān)于異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究還比較少，本研究將通過建立H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探索異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用以及其對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，以期了解異鼠李素的作用機(jī)制并對(duì)臨床做出指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料DMEM(dulbecco's modified eagle medium，批號(hào): 8114057)培養(yǎng)基購自Gibco公司，MTT(批號(hào): 2399B477)和胰酶(批號(hào): 3049B047)購自Amresco公司，F(xiàn)BS (fetal bovine serum，批號(hào): 090722)購自四季青公司，ROS檢測(cè)試劑(批號(hào): 1275755)及凋亡檢測(cè)試劑(批號(hào)808365)購自Invitrogen公司，JC-1試劑(批號(hào): 30MYL0)購自ENZO公司，DMSO(dimethyl sulphoxide，批號(hào): 089K1407V)購自Sigma公司，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(批號(hào): P0028)購自碧云天公司，Western blot一抗(批號(hào): cytochrome，c-sc-13560; caspase-9，sc-7885; caspase-3，sc-7148; bcl-2，sc-492; Nrf2，G1916; HO-1，F(xiàn)0216;β-actin，sc-1616; lamin B，sc-374015)購自Santa Cruz公司，Western blot二抗(批號(hào):105134)購自中杉金橋公司?？捡R斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒(A045-2)，過氧化氫酶(catalase，CAT)測(cè)定試劑盒(A007-1)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒(A005)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1)，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測(cè)試盒(A001-1)購自南京建成生物工程研究所。

1.2儀器流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.3細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)MTT法用無血清DMEM將異鼠李素配制成不同濃度，并與H9C2細(xì)胞共孵育12 h，然后向正常組以外的實(shí)驗(yàn)組加入無血清DMEM配制的300 μmol·L－1H2O2孵育4 h(在異鼠李素的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中省略H2O2孵育)。吸棄所有實(shí)驗(yàn)組的上清，加入200 μL 1 g·L－1MTT溶液，孵育4 h。加入200 μL DMSO，混勻后在570 nm波長下測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡及活性氧自由基水平變化實(shí)驗(yàn)組分為正常組(N)、模型組(M)、治療組(M+ ISO)、單給藥組(ISO)。用步驟“1.3”中確定的最佳異鼠李素濃度，與治療組及單給藥組的H9C2細(xì)胞預(yù)孵育12 h，其他組用無血清DMEM預(yù)孵育。預(yù)孵育結(jié)束后，用300 μmol·L－1H2O2溶液對(duì)模型組與治療組造模，其他兩組換成新鮮無血清DMEM。4 h后消化細(xì)胞，用凋亡試劑盒內(nèi)的200 μL binding buffer重懸各組細(xì)胞，再用5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V工作液與1 μL PI工作液共同孵育細(xì)胞懸液15 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè);在檢測(cè)ROS過程中，向培養(yǎng)板中加入用無血清DMEM配制的25 μmol·L－1的ROS探針，將各組H9C2細(xì)胞于37℃下避光孵育0.5 h，再用PBS洗兩次，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位變化對(duì)各組H9C2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)給藥并造模后，向培養(yǎng)板中加入用無血清DMEM配制的2μmol·L－1JC-1探針，于37℃下避光孵育0.5 h，再用PBS洗兩次。用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。統(tǒng)計(jì)結(jié)果由image-pro plus軟件分析得出。

1.6細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、CAT、GSH-Px的測(cè)定對(duì)各組H9C2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)給藥并造模后，消化并收集細(xì)胞，用－80℃冰箱將各組細(xì)胞反復(fù)凍融3次，提取細(xì)胞內(nèi)容物，并按照檢測(cè)MDA、SOD、CAT、GSHPx試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)

1.7.1胞質(zhì)蛋白提取對(duì)各組H9C2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)給藥并造模后，用PBS洗滌細(xì)胞1次并消化，400× g 10 min離心細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解液400 μL重懸，于4℃裂解1 h。800×g離心15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.7.2核蛋白提取收集“1.7.1”中的沉淀，并加入50 μL核蛋白抽提試劑，劇烈震蕩5 min，于4℃靜置30 min。800×g 15 min離心，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.7.3Western blot步驟每組取20 μg的總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入細(xì)胞質(zhì)cytochrome C、caspase-9、caspase-3、bcl-2、Nrf2、HO-1、β-actin、lamin B、Nrf2、HO-1一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜; TBST溶液洗滌3次(×15 min)，加入辣根素過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育4 h，TBST溶液洗膜3次(×15 min)，化學(xué)發(fā)光法顯影。在檢測(cè)Nrf2及HO-1的實(shí)驗(yàn)中，未對(duì)細(xì)胞進(jìn)行造模。所檢測(cè)的蛋白表達(dá)為異鼠李素對(duì)正常細(xì)胞抗氧化通路的作用。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料轉(zhuǎn)成正態(tài)分布后再采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1異鼠李素的毒性作用以及對(duì)H2O2引起的H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用MTT結(jié)果(Fig 1A)顯示，0～40 μmol·L－1的異鼠李素溶液與H9C2細(xì)胞共孵育12 h未見毒性作用，各組活率與正常組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。80(P＜0.05)與160 μmol·L－1(P＜0.01)的異鼠李素則使H9C2細(xì)胞的活率明顯下降。異鼠李素的保護(hù)作用結(jié)果則表明(Fig 1B)，15 μmol·L－1的異鼠李素對(duì)H2O2致H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用較好，其與模型組M相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。20 μmol·L－1的異鼠李素也具有保護(hù)作用，差異有顯著性(P＜0.05)。與模型組相比，其他濃度的作用沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，由于這些濃度還未至異鼠李素的毒性作用濃度，因此，保護(hù)作用的降低并非是由于異鼠李素毒性的原因。

2.2異鼠李素對(duì)H2O2引起的H9C2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用在檢測(cè)線粒體膜電位的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，本實(shí)驗(yàn)利用紅綠熒光的比例來體現(xiàn)線粒體膜電位去極化的程度。紅色熒光表達(dá)越強(qiáng)，或者表達(dá)比例越高，說明去極化程度越弱。由Fig 2A，C可知，與正常組相比，模型組的線粒體膜電位去極化明顯(P＜0.01)。15 μmol·L－1異鼠李素可緩解治療組H9C2細(xì)胞的MMP去極化(P＜0.01)。對(duì)凋亡水平(Fig 2B，D)的檢測(cè)也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，與模型組相比，治療組的凋亡細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.01)。而與正常組相比，單給藥組的MMP去極化與細(xì)胞凋亡水平均沒有差異(P＞0.05)。因此，15 μmol·L－1的異鼠李素對(duì)于H2O2引起H9C2的MMP去極化、細(xì)胞凋亡都有抑制的作用。

2.3異鼠李素對(duì)H2O2損傷的H9C2凋亡信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與模型組相比，異鼠李素可以明顯降低治療組H9C2的Bax、胞質(zhì)細(xì)胞色素C、caspase-9與caspase-3的表達(dá)(P＜0.01)，并能夠提高由于損傷而降低的Bcl-2的表達(dá)(P＜0.01)。這些結(jié)果提示，異鼠李素治療組可以抑制氧化應(yīng)激引起的H9C2細(xì)胞凋亡，而這種保護(hù)作用是通過抑制線粒體凋亡通路來實(shí)現(xiàn)的。

2.4異鼠李素對(duì)H2O2損傷H9C2細(xì)胞ROS，MDA，SOD，CAT，GSH-Px產(chǎn)生的影響為了研究異鼠李素對(duì)H9C2細(xì)胞抗氧化能力的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)產(chǎn)生的變化。本實(shí)驗(yàn)首先研究了異鼠李素對(duì)H2O2造成H9C2細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS的影響。結(jié)果表明(Fig 4A)異鼠李素可以保護(hù)H9C2細(xì)胞，抑制H2O2造成的過量ROS產(chǎn)生。與模型組相比，治療組ROS的產(chǎn)生明顯降低(P＜0.05)。MDA是細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，其含量可以反映出細(xì)胞損傷的程度，SOD、CAT與GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，對(duì)細(xì)胞的氧化損傷起著重要的保護(hù)作用［5］。如Fig 4B所示，模型組的MDA含量較正常組明顯升高(P＜0.01)，經(jīng)異鼠李素預(yù)孵育后則使MDA明顯降低(P＜0.01)。另一方面，與正常組相比，模型組的抗氧化酶SOD、CAT與GSH-Px都明顯下降(Fig 4 C，D，E，P＜0.01)。而治療組的抗氧化酶產(chǎn)量均較模型組明顯增加(P＜0.01)。單獨(dú)給予異鼠李素處理組的ROS、MDA、SOD、CAT與GSH-Px較正常組差異均無顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Toxicity of isorhamnetin and its protective effect on oxidatively injured H9C2 cell line

2.5異鼠李素對(duì)H2O2損傷的H9C2的Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響接下來，本實(shí)驗(yàn)研究了異鼠李素對(duì)抗氧化信號(hào)通路的影響。由于Nrf2/ARE信號(hào)通路是體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路，本研究推測(cè)異鼠李素的抗氧化應(yīng)激作用可能與該通路相關(guān)。根據(jù)Western blot的結(jié)果(Fig 5)可知，在4～24 h這段時(shí)間內(nèi)，異鼠李素逐漸增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及抗氧化酶HO-1的表達(dá)，抗氧化作用不斷增強(qiáng)。這表明異鼠李素對(duì)H9C2細(xì)胞的保護(hù)至少部分是通過Nrf2/ARE信號(hào)通路來發(fā)揮作用的。

Fig 2 Effects of isorhamnetin on apoptosis of oxidatively injured H9C2 cell line

3　討論

在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生及發(fā)展的過程中，氧化應(yīng)激損傷起著重要的作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致大量氧化中間產(chǎn)物的產(chǎn)生。ROS包括超氧陰離子(·O2－)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等。氧化應(yīng)激損傷中產(chǎn)生的過量ROS會(huì)損傷心肌細(xì)胞線粒體，刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C，繼而活化caspase家族，如caspase-9、caspase-3等，并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡［6］。除此之外，ROS還能夠引起炎癥反應(yīng)及低密度脂蛋白氧化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞增生，促使冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊形成［7］。有研究表明，異鼠李素可以緩解ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的損傷［8］。本實(shí)驗(yàn)利用H2O2損傷H9C2細(xì)胞的模型來模擬過量ROS損傷心肌細(xì)胞，并探索異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，15 μmol·L－1的異鼠李素可以保護(hù)H9C2細(xì)胞，對(duì)抗H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷。而其他濃度沒有改善效果，毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在孵育時(shí)間相同的條件下，異鼠李素從80 μmol·L－1的濃度才開始出現(xiàn)H9C2的細(xì)胞毒性作用。這些結(jié)果提示，異鼠李素能夠降低H2O2對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的損傷，并且在15 μmol·L－1的濃度下具有最佳的保護(hù)作用。隨著濃度的增加，異鼠李素的保護(hù)作用逐漸減弱，而這種減弱并非是由于細(xì)胞毒作用造成的。

心肌細(xì)胞的凋亡是心肌損傷的重要機(jī)制。在心肌細(xì)胞的凋亡中，線粒體起著重要的作用。在線粒體內(nèi)膜上，存在著名為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的孔道(mPTP)。氧化應(yīng)激等損傷會(huì)促使mPTP開放，而mPTP的持續(xù)開放會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，并釋放線粒體內(nèi)的促凋亡物質(zhì)如細(xì)胞色素C至細(xì)胞質(zhì)中［9］，繼而導(dǎo)致caspase-9、-3的活化，最終引起細(xì)胞凋亡［6］。線粒體同時(shí)也是Bcl-2基因家族發(fā)揮作用的場(chǎng)所，Bcl-2基因家族包括抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-lx與促凋亡基因Bax、Bad、Bid、Bnip3。Bax轉(zhuǎn)位至線粒體中則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，而抗凋亡蛋白Bcl-2能夠保持線粒體膜的完整性、穩(wěn)定性，并與Bax形成二聚體，減少細(xì)胞色素C的釋放［10］。因此本實(shí)驗(yàn)研究了異鼠李素對(duì)線粒體膜電位以及細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2促進(jìn)H9C2細(xì)胞線粒體膜電位去極化，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并使caspase-9與caspase-3相繼活化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。Bcl-2的表達(dá)下調(diào)與Bax上調(diào)也同樣表明線粒體受到損傷，線粒體凋亡通路被活化。而異鼠李素逆轉(zhuǎn)了治療組細(xì)胞的上述指標(biāo)，這表明異鼠李素能夠作用于心肌細(xì)胞的線粒體凋亡通路，抑制H2O2對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，降低了心肌細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Effect of isorhamnetin on apoptotic signal pathway of oxidatively injured H9C2 cell line

Fig 4 Effects of isorhamnetin on ROS，MDA，SOD，CAT，GSH-Px generations of oxidatively injured H9C2 cell line

Fig 5 Effect of isorhamnetin on Nrf2/ARE signal pathway of H9C2 cell line

ROS的作用是復(fù)雜的。一方面，ROS是機(jī)體正常功能所必需的，是線粒體呼吸作用的正常副產(chǎn)物［11］。它還可以作為一種信號(hào)分子，活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，維持細(xì)胞正常機(jī)能與氧化還原狀態(tài)，甚至還會(huì)參與組織的再生與修復(fù)［12］;另一方面，ROS又與心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷存在著密切的關(guān)系，過量的ROS可以損傷心肌細(xì)胞的脂質(zhì)、DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子，從而加重心臟的損傷［13］。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的缺血階段，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物活性降低，ROS產(chǎn)生增加。而當(dāng)再灌注發(fā)生時(shí)，線粒體受到氧化應(yīng)激損傷，會(huì)產(chǎn)生過量的ROS，這些ROS會(huì)再次損傷線粒體，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單給藥組的ROS產(chǎn)生與正常組相比不存在差異，這說明異鼠李素并未對(duì)生理水平的ROS產(chǎn)生影響。而H2O2則會(huì)引起H9C2心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)量增加，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px產(chǎn)量降低，造成過量的ROS得不到有效的清除。這些過量的ROS會(huì)氧化生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的生物大分子，并產(chǎn)生有害的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)［14］，因此H9C2細(xì)胞內(nèi)MDA明顯增加。由于ROS也會(huì)損傷線粒體，如線粒體膜、DNA、蛋白質(zhì)等［11］，因此過量的ROS能夠造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，引起線粒體凋亡通路活化，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這也可能是H2O2導(dǎo)致H9C2細(xì)胞凋亡的原因。而異鼠李素能夠緩解治療組H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激負(fù)荷，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化，并提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶水平。憑借這些作用，異鼠李素能夠抑制H9C2心肌細(xì)胞的線粒體凋亡途徑，達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

Nrf2/ARE信號(hào)通路是抗氧化的重要通路，Nrf2 與Keap1以無活性的二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激刺激后，Nrf2與Keap1分離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)Nrf2與Maf、抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant responsive element，ARE)結(jié)合并調(diào)控二相抗氧化酶如HO-1等的表達(dá)［15］。在某些情況下，例如血管老化，Nrf2不能對(duì)ROS做出反應(yīng)，這將導(dǎo)致血管及心臟的氧化應(yīng)激損傷［16］。由Western blot的結(jié)果可知，隨著孵育時(shí)間的增加，異鼠李素可以逐漸增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及其所調(diào)控的二相抗氧化酶HO-1的表達(dá)。這表明異鼠李素可以活化Nrf2/ARE信號(hào)通路，并增加其下游二相抗氧化酶的表達(dá)。有研究表明，Nrf2能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)抗氧化，抗細(xì)胞凋亡的作用［17］。本研究結(jié)果提示，異鼠李素可以通過促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，活化Nrf2/ARE通路，并抑制細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激負(fù)荷，促進(jìn)細(xì)胞存活。

綜上所述，本研究采用H2O2誘導(dǎo)的H9C2氧化損傷模型，探索異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。研究的結(jié)果表明，異鼠李素具有抗氧化、抗凋亡作用，其機(jī)制是通過活化Nrf2通路來提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力，抑制心肌細(xì)胞凋亡。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用異鼠李素治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病提供了支持，也為開發(fā)治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病藥物提供了依據(jù)。

(致謝:本研究于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心完成。感謝實(shí)驗(yàn)室的各位老師與同學(xué)給予的大力支持和無私幫助。)

參考文獻(xiàn):

［1］Rodrigo R，Libuy M，F(xiàn)eliu F，et al.Molecular basis of cardioprotective effect of antioxidant vitamins in myocardial infarction［J］.Biomed Res Int，2013，2013: 437613.

［2］Lee J H，Khor T O，Shu L，et al.Dietary phytochemicals and cancer prevention: Nrf2 signaling，epigenetics，and cell death mechanisms in blocking cancer initiation and progression［J］.Pharmacol Ther，2013，137(2) : 153－71.

［3］Bozaykut P，Karademir B，Yazgan B，et al.Effects of vitamin E on peroxisome proliferator-activated receptor gamma and nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 in hypercholesterolemia-inducedatherosclerosis［J］.Free Radic Biol Med，2014，70: 174－81.

［4］趙增光，劉應(yīng)才.異鼠李素的心血管保護(hù)作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008 (15) : 2321－3.

［4］Zhao Z G，Liu Y C.Cardiovascular protective effect of isorhamnetin［J］.Med Recap，2008 (15) : 2321－3.

［5］Meng X B，Sun G B，Wang M，et al.P90RSK and Nrf2 Activation via MEK1/2-ERK1/2 pathways mediated by Notoginsenoside R2 to prevent 6-hydroxydopamine-induced apoptotic death in SHSY5Y cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013: 971712.

［6］Rajendran P，Nandakumar N，Rengarajan T，et al.Antioxidants and human diseases［J］.Clin Chim Acta，2014，436C: 332－47.

［7］Vichova T，Motovska Z.Oxidative stress: Predictive marker for coronary artery disease［J］.Exp Clin Cardiol，2013，18(2) : e88 －91.

［8］Bao M，Lou Y.Isorhamnetin prevent endothelial cell injuries from oxidized LDL via activation of p38MAPK［J］.Eur J Pharmacol，2006，547(1－3) : 22－30.

［9］Solesio M E，Saez-Atienzar S，Jordan J，et al.3-Nitropropionic acid induces autophagy by forming mitochondrial permeability transition pores rather than activating the mitochondrial fission pathway ［J］.Br J Pharmacol，2013，168(1) : 63－75.

［10］謝飛，魏珂，閔蘇，等.神經(jīng)生長因子對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30(4) : 506－10.

［10］Xie F，Wei K，Min S，et al.Anti-apoptotic effect of NGF on H9c2 cardiac myocytes in a hypoxia/reoxygenation injury model［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(4) :506－10.

［11］Dai D F，Chiao Y A，Marcinek D J，et al.Mitochondrial oxidative stress in aging and healthspan［J］.Longev Healthspan，2014，3: 6.

［12］Urao N，Ushio-Fukai M.Redox regulation of stem/progenitor cells and bone marrow niche［J］.Free Radic Biol Med，2013，54: 26 －39.

［13］Rodrigo R，Prieto J C，Castillo R.Cardioprotection against ischaemia/reperfusion by vitamins C and E plus n-3 fatty acids: molecular mechanisms and potential clinical applications［J］.Clin Sci (Lond)，2013，124(1) : 1－15.

［14］Han S，Zhang H，Qin L，et al.Effects of dietary carbohydrate replaced with wild rice (Zizania latifolia (Griseb) Turcz) on insulin resistance in rats fed with a high-fat/cholesterol diet［J］.Nutrients，2013，5(2) : 552－64.

［15］Kansanen E，Kuosmanen S M，Leinonen H，et al.The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer［J］.Redox Biol，2013，1(1) : 45－9.

［16］Cho Y H，Cha M J，Song B W，et al.Enhancement of MSC adhesion and therapeutic efficiency in ischemic heart using lentivirus delivery with periostin［J］.Biomaterials，2012，33(5) : 1376－85.

［17］Fan J，Xu G，Jiang T，et al.Pharmacologic induction of heme oxygenase-1 plays a protective role in diabetic retinopathy in rats ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(10) : 6541－56.

Protective effect of isorhamnetin on H9C2 cell line against oxidative stress

DONG Xi1，SUN Gui-bo2，LUO Yun2，SUN Xiao-bo2，CHEN Su-hong1
(1.Wenzhou Medical University，Wenzhou Zhejiang 325035，China; 2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effect of isorhamnetin on H9C2 myocardial cell line and its mechanisms.Methods The toxicity and optimal protective concentration of isorhamnetin were determined by MTT assay.The experimental subjects were divided into four groups: group N (normal)，group M (model)，group M+ ISO (model+ isorhamnetin)，and group ISO (isorhamnetin only).Group M+ ISO and ISO were pre-incubated with isorhamnetin for 12 hours while other groups with plain DMEM.Group M and M+ ISO were treated with 300μmol·L(－1)H2O2for 4 hours after pre-incubation.Mitochondrial membrane potential depolarization of H9C2 was measured by fluorescence microscope.Apoptotic rate and ROS production of injured myocardial cell line were detected using flow cytometry.The oxidative indictors were measured by spectrophotometry.The expressions of cytoplasmic cytochrome C，caspase-9，caspase-3，Bcl-2，Bax，Nrf2 and HO-1 were examined by Western blot.Result There was no difference in mitochondrial membrane potential depolarization，apoptotic rate，ROS production，oxidative indictors production and expressions of cytoplasmic cytochrome C，caspase-9，caspase-3，Bcl-2，Bax between groups ISO and N (P＞0.05).Apoptotic rate，ROS production，expressions of cytoplasmic cytochrome C，caspase-9，caspase-3，Bax，MDA production of group M+ ISO were significantly lower than those of group M (P＜0.01).And mitochondrial membrane potential，Bcl-2，CAT，SOD and GSH-Px of group M+ ISO were increased compared to group M.book=860,ebook=125Nuclear translocation of Nrf2 and expression of HO-1 in myocardial cell line were increased with the prolonged isorhamnetin incubation time.ConclusionIsorhamnetin could protect myocardial cell line against H2O2-induced oxidative injury and apoptosis through the interruption of mitochondrial dependent apoptotic pathway and activation of Nrf2/ARE pathway.

Key words:isorhamnetin; myocardial cells; oxidative stress; apoptosis; anti-oxidation; atherosclerosis

作者簡(jiǎn)介:董曦(1985－)，男，碩士生，研究方向:心血管藥理學(xué)，E-mail: dx5212004@126.com;陳素紅(1973－)，女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥藥效學(xué)與中藥新產(chǎn)品開發(fā)，通訊作者，Tel/Fax: 0571-86613601，E-mail: chensuhong06@ yahoo.com.cn;孫曉波(1958－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，通訊作者，Tel/Fax: 010-57833013，E-mail: sun-xiaobo@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81374011)

收稿日期:2015－02－16，修回日期:2015－03－02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0853－08中國圖書分類號(hào): R282.71; R322.11; R329.25; R349.1; R543.5

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.023