蘇勤勇，李曉梅，姚景春，王平平，張貴民

(魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東臨沂　276006)

?

牛蒡子苷元對大鼠腦膠質(zhì)瘤的作用及初步作用機制探討

蘇勤勇，李曉梅，姚景春，王平平，張貴民

(魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東臨沂276006)

摘要:目的觀察牛蒡子苷元對大鼠C6膠質(zhì)瘤的作用及作用機制的研究。同時探討牛蒡子苷元與替莫唑胺合用對腦膠質(zhì)瘤是否有協(xié)同作用。方法采用腦內(nèi)注射C6膠質(zhì)瘤細胞建立大鼠C6膠質(zhì)瘤模型;牛蒡子苷元連續(xù)皮下給藥15 d，替莫唑胺從d 5開始給藥，連續(xù)灌胃給藥5 d;測量腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積;采用免疫組化方法檢測腦瘤組織中GFAP、PCNA和CD40的表達。結(jié)果與模型組相比，牛蒡子苷元均能明顯降低大鼠C6膠質(zhì)瘤的腫瘤體積(P＜0.05)，給予牛蒡子苷元可使腦膠質(zhì)瘤大鼠的PCNA和CD40表達明顯降低(P＜0.05)，GFAP表達明顯升高(P＜0.05) ;牛蒡子苷元與替莫唑胺合用能明顯減少腦膠質(zhì)瘤大鼠的腫瘤體積(P＜0.01)，其腫瘤抑制率均高于單獨牛蒡子苷元和替莫唑胺;與模型組相比，聯(lián)合用藥組的PCNA和CD40表達均明顯降低(P＜0.05)，GFAP明顯升高(P＜0.05)，均好于單獨用藥。結(jié)論牛蒡子苷元能明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤生長，并且與替莫唑胺合用具有協(xié)同作用，作用機制與影響腦膠質(zhì)瘤相關(guān)蛋白(PCNA和GFAP)表達和調(diào)節(jié)機體免疫(抑制CD40表達)相關(guān)，為牛蒡子苷元上報新藥提供臨床前藥理試驗支持。

關(guān)鍵詞:腦膠質(zhì)瘤;牛蒡子苷元;替莫唑胺; PCNA; GFAP; CD40;新藥

腦膠質(zhì)瘤亦稱神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤，由神經(jīng)上皮組織衍化而來，具有發(fā)病率高、病死率高和治愈率低的特點，手術(shù)切除是當前最主要的臨床治療手段。由于膠質(zhì)瘤本身固有的浸潤性生長的病理特點，手術(shù)后的復發(fā)仍不可避免，采用安全有效的方法進行膠質(zhì)瘤的治療成為亟待解決的問題。天然藥物單體化合物可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化或凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。牛蒡子為菊科植物牛蒡(Arctium Lappa L.)的干燥成熟果實。癌細胞體外及體內(nèi)實驗證明，牛蒡子具有抗癌性［1］。米靖宇等［2］經(jīng)過歸納總結(jié)認為，牛蒡子中具有抗腫瘤和免疫活性的有效成分主要為牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)。牛蒡子苷元體內(nèi)外試驗表明，其可抑制多種腫瘤細胞的生長，其抗腫瘤作用主要集中在促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖等方面［1］。檢索國內(nèi)外文獻尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)牛蒡子苷元對腦膠質(zhì)瘤相關(guān)作用的報道。本試驗采用大鼠腦內(nèi)注射C6膠質(zhì)瘤細胞建立大鼠腦瘤模型，研究牛蒡子苷元及聯(lián)合抗腦膠質(zhì)瘤藥物替莫唑胺對大鼠C6膠質(zhì)瘤的作用，同時觀察其對腦瘤組織中的增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、膠質(zhì)纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及CD40表達的作用。

1　材料與方法

1.1藥物和試劑牛蒡子苷元注射液(山東新時代藥業(yè)有限公司) ;大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細胞株系(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心) ;替莫唑胺原料(北京嘉瑞時代科技有限公司) ;免疫組化PCNA和CD40試劑盒(Santa Cruze) ;免疫組化GFAP試劑盒(北京中杉金橋有限公司)。

1.2儀器超凈工作臺(SW-CJ-1BU型，蘇凈集團安泰公司制造) ;倒置熒光顯微鏡(CKX41型，日本奧林巴斯公司) ;組織包埋機(Tissue-TekTECTM5.，日本櫻花科技) ;全封閉組織脫水機(Tissue-TekVIPTM5Jr，日本櫻花科技)。

1.3動物健康♂SD大鼠，SPF級，90只，體質(zhì)量(200±20) g。魯南制藥集團股份有限公司試驗動物中心提供，動物許可證號: SCXK (魯) 2012 0002;質(zhì)量合格證號:0015264。

1.4細胞培養(yǎng)及處理大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細胞，取對數(shù)期細胞，消化，分散均勻，濃度為1×1011·L－1，C6細胞使用含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當細胞處于對數(shù)生長期時，用胰蛋白酶適量消化3～5 min后，棄去消化液。用PBS液吹打沖洗1～2次形成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×1010·L－1的懸液用于接種［3］。

1.5大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立SD大鼠尾靜脈注射1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)后，脫去大鼠頭頂部毛發(fā)，頭頂雙側(cè)眼裂連線后大約1.5 cm處橫向切開頭皮，暴露前囪顱骨標志，前囪中點前1 mm，矢狀縫旁開3 mm處用自制牙鉆鉆一骨孔，微量注射器抽取C6細胞懸液10 μL，垂直固定于試驗臺上，經(jīng)原骨孔處進針硬腦膜下6 mm，后退1 mm，于10 min內(nèi)將細胞懸液注完(2 μL·min－1)，注射完畢后留針5 min，緩慢退針，骨蠟封閉骨孔，1號絲線縫合頭皮切口［4－6］。

1.6動物分組及給藥90只大鼠隨機分為6組，分別為模型組(M)、低劑量牛蒡子苷元組(ARG 0.05，0.05 mg·kg－1)、高劑量牛蒡子苷元組(ARG 0.1，0.1 mg·kg－1)、替莫唑胺組(TMZ，20 mg· kg－1)、低劑量牛蒡子苷元+替莫唑胺組(TMZ/ARG 0.05)、高劑量牛蒡子苷元+替莫唑胺組(TMZ/ARG 0.1)，每組15只。牛蒡子苷元于術(shù)后d 2開始皮下給藥［0.1 mL·(100 g)－1］，連續(xù)給藥15 d，替莫唑胺于接種后d 5開始灌胃給藥，1 mL·(100 g)－1連續(xù)給予5 d，其余各組灌胃給予相同體積的質(zhì)量分數(shù)為0.5%的CMC-Na。

1.7結(jié)果判定標準術(shù)后d 16以過量戊巴比妥鈉麻醉處死實驗動物，斷頭取腦，全腦于3%甲醛中固定1周，沿進針點作冠狀切口，測量腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積V=πab2/6(b為短徑)。抑瘤率/%=(模型組的腫瘤體積－實驗組的腫瘤體積)/模型組腫瘤的平均體積×100%，抑制率＞30%為腫瘤對藥物敏感。同時石蠟切片，行PCNA、GFAP和CD40免疫組織化學染色檢測，染色操作過程按照試劑盒說明書進行。將已染好的切片在顯微鏡下觀察并拍照，采用IPP病理圖像分析軟件計算GFAP陽性表達的光密度及CD40陽性細胞的IOD值和面密度; PCNA結(jié)果以胞核或(和)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性，光鏡高倍視野下(400倍)陽性細胞數(shù)所占總腫瘤細胞數(shù)的百分率為PCNA陽性指數(shù)。

2　結(jié)果

2.1對大鼠腫瘤體積及抑瘤率的影響由Tab 1可以看出，與模型組相比，低、高劑量牛蒡子苷元組和替莫唑胺組的腫瘤體積降低(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組的腫瘤體積明顯降低(P＜0.01)。表明牛蒡子苷元單用及聯(lián)用均對大鼠腦膠質(zhì)瘤有抑制作用，并且牛蒡子苷元與替莫唑胺聯(lián)用具有協(xié)同作用。所有給藥組的抑瘤率均＞40.65%，顯示大鼠C6膠質(zhì)瘤對牛蒡子苷元及聯(lián)合用藥敏感。

Tab 1 Effects of arctigenin on tumor volume(±s，n=15)

Tab 1 Effects of arctigenin on tumor volume(±s，n=15)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group　Tumor size/mm3Inhibitory rate/% Model　153.7±32.6 Low ARG　91.2±17.6*　40.6 High ARG　78.5±26.0*　48.9 Temozolomide　68.1±19.7*　55.7 Low ARG+Temozolomide　64.6±16.7＊＊　58.0 High ARG+Temozolomide　66.8±19.2＊＊56.5

2.2對大鼠C6膠質(zhì)瘤PCNA表達的影響PCNA陽性細胞的胞核呈黃色或棕黃色，400倍鏡下計數(shù)腫瘤內(nèi)5個視野的陽性細胞。由Fig 1可以看出，模型組大鼠腫瘤細胞表現(xiàn)為陽性細胞密度高，胞核呈陽性，數(shù)量多。與模型組相比，低劑量及高劑量牛蒡子苷元的PCNA陽性表達率明顯降低(P＜0.05) ;牛蒡子苷元聯(lián)合替莫唑胺組的PCNA陽性表達率也明顯降低(P＜0.01)，并且聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨牛蒡子苷元和替莫唑胺。表明牛蒡子苷元可以明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞增殖，并且與替莫唑胺聯(lián)用可以協(xié)同抑制C6膠質(zhì)瘤增殖。

2.3對大鼠C6膠質(zhì)瘤GFAP表達的影響GFAP免疫組化陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色，400倍鏡下計數(shù)腫瘤內(nèi)3個視野的陽性細胞，計數(shù)腫瘤內(nèi)GFAP陽性表達。低劑量牛蒡子苷元組的GFAP表達與模型組相比有升高的趨勢，但差異無顯著性。除低劑量牛蒡子苷元組外，其余給藥組GFAP陽性表達，瘤內(nèi)光密度值較模型組均明顯增強(P＜0.05)。表明牛蒡子苷元單用及聯(lián)用均可以明顯增強GFAP表達，見Fig 2。

2.4對大鼠C6膠質(zhì)瘤CD40表達的影響CD40免疫組化陽性染色定位于細胞膜、細胞質(zhì)。由Tab 2 及Fig 3可以看出，牛蒡子苷元IOD值(P＜0.01)和面密度值(P＜0.05)均明顯低于模型組;聯(lián)合用藥組的IOD值(P＜0.01)和面密度值(P＜0.01)也明顯低于模型組，并且好于單獨牛蒡子苷元和替莫唑胺。表明牛蒡子苷元可以明顯抑制CD40表達，并且同替莫唑胺聯(lián)用具有協(xié)同作用。

3　討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的32%。2012年，中國腫瘤登記報告指出中國腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤死亡率約為3.87/10萬，位列十大高病死率腫瘤之第9位。替莫唑胺是國際上治療腦膠質(zhì)瘤的一線藥物，但是其作為化療藥物，全身毒性反應較大，對患者的免疫力影響較大。幾十年來，天然產(chǎn)物一直是藥物和藥物先導化合物的重要來源。天然抗腫瘤藥物以其作用機制獨特、效果明顯、毒副作用小在臨床廣泛使用。目前臨床使用量已占到腫瘤治療藥物的74%。

腦膠質(zhì)瘤中PCNA和GFAP的表達水平呈負相關(guān)，PCNA的過度表達導致了細胞周期調(diào)節(jié)紊亂，影響膠質(zhì)瘤的增殖和分化，參與了膠質(zhì)瘤的惡性進展，它的表達與膠質(zhì)瘤的惡性行為相關(guān)［7－8］。而GFAP是星形膠質(zhì)細胞及其發(fā)生腫瘤的最佳特征性標記物［9］。研究發(fā)現(xiàn)，GFAP強陽性表達往往標志著瘤細胞趨于成熟，分化良好，預后較好［10］。觀察PCNA 與GFAP的表達是評價膠質(zhì)瘤增殖、生長、分化及惡性程度的主要指標。CD40信號的高表達與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、微血管形成等存在正相關(guān)性。CD40信號可直接刺激腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的多種細胞，產(chǎn)生IL-6、MMP、VEGF等一系列利于腫瘤生長和促進腫瘤新生血管形成的細胞因子［11－12］。

Tab 2 Effects of arctigenin on CD40 expressionin rat glioma(±s，n =15)

Tab 2 Effects of arctigenin on CD40 expressionin rat glioma(±s，n =15)

?

Fig 1 Expression of PCNA on rat tumor issue(×400)

Fig 2 Expression of GFAP on rat tumor issue (×400)

Fig 3 Expression of CD40 on rat tumor issue (×400)

本實驗表明，牛蒡子苷元能明顯減少C6膠質(zhì)瘤大鼠的腫瘤體積，并且牛蒡子苷元作為天然產(chǎn)物單體，其抗腫瘤作用并非類似于替莫唑胺單純依靠其對腫瘤細胞的特異性殺滅，而是同時發(fā)揮對荷瘤大鼠的全面調(diào)節(jié)作用，如改善機體免疫功能，調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境，拮抗替莫唑胺和腫瘤本身對機體功能的損害。同時本實驗還觀察了牛蒡子苷元對PCNA、GFAP和CD40表達的影響，研究結(jié)果顯示，牛蒡子苷元可以明顯降低PCNA、CD40表達，升高GFAP表達，表明牛蒡子苷元抑制膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤的生長，作用機制可能與影響相關(guān)蛋白(降低PCNA、升高GFAP)表達和調(diào)節(jié)機體免疫(抑制CD40表達)相關(guān)。

此外，本研究還觀察了牛蒡子苷元與替莫唑胺合用對大鼠C6膠質(zhì)瘤是否具有協(xié)同作用。結(jié)果顯示，牛蒡子苷元與替莫唑胺合用可以協(xié)同抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤生長，無論低劑量牛蒡子苷元，還是高劑量牛蒡子苷元聯(lián)合替莫唑胺的腫瘤抑制率均高于單獨的牛蒡子苷元和替莫唑胺，并且兩者聯(lián)用能協(xié)同抑制PCNA表達和增強GFAP表達，同時其CD40的IOD和面密度值均低于單獨用藥，表明牛蒡子苷元和替莫唑胺合用在影響膠質(zhì)瘤相關(guān)蛋白表達和免疫調(diào)節(jié)(抑制CD40表達)作用機制方面也具有協(xié)同作用。

綜上所述，牛蒡子苷元能明顯抑制大鼠C6腦膠質(zhì)瘤生長;同時牛蒡子苷元(0.05和0.1 mg· kg－1)和抗膠質(zhì)瘤藥替莫唑胺(20 mg·kg－1)合用具有協(xié)同作用，作用機制可能與抑制PCNA和CD40的表達、增強GFAP的表達相關(guān)。腦膠質(zhì)瘤細胞生長增殖是一個極其復雜的生物學過程，影響因素很多，目前牛蒡子苷元抑制膠質(zhì)瘤細胞生長相關(guān)機制目前尚無定論，更多詳細的機制需要進一步研究。牛蒡子苷元已經(jīng)作為中藥一類新藥上報到國家食品藥品監(jiān)督管理局，本次試驗為牛蒡子苷元作為一類新藥上報提供臨床前藥理實驗支持。

(本實驗在魯南制藥集團股份有限公司/中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室完成，感謝實驗室提供的技術(shù)資金支持，感謝實驗室同事提供的大力幫助。)

參考文獻:

［1］鄭國燦.牛蒡子提取液的抗癌性研究［J］.東南大學學報(醫(yī)學版)，2003，22(5) :319－22.

［1］Zheng G C.The study of antitumor to the extract of Arctium lappa L［J］.J Southeast Univ (Med Sci Edit)，2003，22(5) :319－22.

［2］米靖宇，宋純清.牛蒡子中木脂素類化合物的抗腫瘤及免疫活性［J］.時珍國醫(yī)國藥，2002，13(3) :168.

［2］Mi J Y，Song C Q.The anti-tumor and immunity activities of lig-nans compound from Arctium lappa L［J］.Lishizhen MED Mat Med Res，2002，13(3) : 168.

［3］王天路，陸利霞，孫濤，譚關(guān)子.聚乳酸——替莫唑胺微膠囊對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤體外和體內(nèi)抑瘤試驗［J］.江蘇醫(yī)藥，2008，34(5) :478－80.

［3］Wang T L，Lu L X，Sun T，Tan G Z.Growth inhibition of polylactic acid temozolomide microspheres on SD rat brain in vitro and in vivo ［J］.Jiangsu Med J，2008，34(5) :478－80.

［4］邱大勝，徐麗瑩，尹明媛，等.注射后留置時間對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的影響［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2008，33(10) : 1260 －3.

［4］Qiu D S，Xu L Y，Yin M Y，et al.The effect of detaining time after injection in rat brain C6 glioma［J］.J Chongqing Med Univ，2008，33(10) :1260－3.

［5］余永強，陳駿，錢銀鋒，等.立體定向建立大鼠C6膠質(zhì)瘤模型［J］.中國藥理學通報，2003，19(2) :222－5.

［5］Yu Y Q，Chen J，Qian Y F，et al.Establishment of rat C6 glioma model by intracranial injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(2) : 222－5.

［6］李蓉，劉國龍，牛道立，等.建立大鼠C6/SD腦膠質(zhì)瘤放射劑量效應模型的實驗研究［J］.解剖學研究，2011，33(1) :4－9.

［6］Li R，Liu G L，Niu D L，et al.Experimental study of radiation on C6 glioma rats model［J］.Anat Res，2011，33(1) :4－9.

［7］張進華，游楓慧，楊衛(wèi)忠，等.欖香烯抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和PCNA基因表達的研究［J］.中國藥理學通報，2008，24(10) :1348－51.

［7］Zhang J H，You F H，Yang W Z，et al.Study on the inhibiti on of cell pro liferation and the expression of PCNA gene of human glioma U251 by elemene［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(10) : 1348－51.

［8］陳罡，羅殿中，侯巧燕，郭芳.PCNA和GFAP在腦星形膠質(zhì)細胞瘤中表達的雙重染色研究［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2005，10(4) :252－4.

［8］Chen G，Luo D Z，Hou Q Y，Guo F.Study of PCNA and GFAP expressions in human brain astrocytomas by double immunohistochemical staining［J］.Chin J Clin Neurosurg，2005，10(4) :252－4.

［9］楊金慶，于耀宇，陶勝忠，等.GFAP，Vimentin，VEGF和p53的表達與星形細胞瘤預后的相關(guān)性研究［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2006，11(9) :535－7.

［9］Yang J Q，Yu Y Y，Tao S Z，et al.Expressions of GFAP，Vimentin，VEGF and p53，and their relationship with prognosis in astrocytoma［J］.Chin J Clin Neurosurg，2006，11(9) :535－7.

［10］張建平，付銀根，劉大全.人參皂苷Rg3對大鼠腦膠質(zhì)瘤GFAP，Vimentin表達的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2009，30 (13) :1173－6.

［10］Zhang J P，F(xiàn)u Y G，Liu D Q.Effects of Ginsenoside Rg3 on GFAP and vimentin expression in rat glioma［J］.J Fourth Mil Med Univ，2009，30(13) :1173－6.

［11］蔡文治，王卓，謝煒，等.CD40基因特異性沉默對腦膠質(zhì)瘤細胞株U87增殖和遷移的影響［J］.蘇州大學學報(醫(yī)學版)，2012，32(1) :36－40.

［11］Cai W Z，Wang Z，Xie W，et al.The effect of CD40 gene silencing on proliferation and migration of glioma cell line U87［J］.J Soochow Univ Med Sci Edit，2012，32(1) :36－40.

［12］Futagami S，Hiratsuka T，Shindo T，et al.COX-2 and CCR2 induced by CD40 ligand and MCP-1 are linked to VEGF production in endothelial cells［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2008，78(2) :137－46.

Effects and primary mechanism of arctigenin in C6 rat glioma

SU Qin-yong，LI Xiao-mei，YAO Jing-chun，WANG Ping-ping，ZHANG Gui-min
(Group Co.Ltd，State Key Laboratory，Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine，Linyi Shandong 276006，China)

Abstract:AimTo observe the effect and primary mechanism of arctigenin (ARG) in C6 rat glioma.At the same time，to investigate the effect of ARG combined with temozolomide.MethodsC6 glioma rat model was established，and 90 rats were divided into six groups，which were subcutaneously administered with model，low and high ARG (0.05 and 0.1 mg· kg(－1)，sc)，temozolomide (20 mg·kg(－1)，p.o.)，low ARG combined with temozolomide(TMZ/ARG 0.05) and high ARG combined with temozolomide(TMZ/ARG 0.1).The tumor specimens of brain were collected after tumor graft.Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)，glial fibrillary acidic protein (GFAP) and CD40 in tumor specimens were determined by immunohistochemistry.Results①Compared with the model group，the tumor sizes of rats in the arctigenin treatment groups were decreased (P＜0.05).②ARG significantly decreased PCNA and CD40 expression (P ＜0.05) and increased GFAP expression (P＜0.05).③Compared with model group，arctigenin combined with temozolomide decreased the tumor sizes (P＜0.01)，and the tumor inhibition rate was higher than that of the arctigenin and temozolomide.At the same time，arctigenin combined with temozolomide decreased PCNA and CD40 expression (P＜0.01) and increased GFAP expression (P＜0.05)，which was better than arctigenin and temozolomide.Conclusion Arctigenin inhibits rat glioma growth，and synergizes with temozolomide，which may be associated with inhibiting PCNA and CD40 expression and strengthening GFAP expression.

Key words:brain glioma; arctigenin; temozolomide;PCNA; GFAP; CD40; new drug

作者簡介:蘇勤勇(1985－)，男，碩士，工程師，研究方向:新藥藥理學，Tel:0539-5030502，E-mail: ntp_sqy@126.com;張貴民(1969－)，男，研究員，研究方向:新藥研發(fā)與管理，通訊作者，Tel: 0539-5030565，E-mail: lunanzhangguimin @126.com

基金項目:國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(No 2012CB724001)

收稿日期:2015－01－16，修回日期:2015－03－10

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0805－05中國圖書分類號: R－332; R284.1; R730.264; R739.410.22; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.014