金恩鴻 樸諄娘 金東春 鞠重基

（1 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院；2 韓國(guó)朝鮮大學(xué) 口腔大學(xué)； 3 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院； * 韓國(guó)朝鮮大學(xué) 口腔大學(xué)）

1 主要試劑和材料

主要菌株與試劑：

①.菌株：H pylori(菌株，由延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，志愿者同意后4病例中采樣提供)；

②.實(shí)驗(yàn)試劑材:Columbia agar base(Gelix Ventech Bio Korea)；Brucel la broth （Becton Dickinson and Company Sparks.USA）；B多粘霉素B(Solar Bio公司)；PCR反應(yīng)引物：16S RNA（27F:AGAGTT TGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTACCTT GTTACG ACT T）：PCR試劑盒：自制快速尿素酶液.

③.實(shí)驗(yàn)儀器：PCR基因擴(kuò)增儀（Bio.Rad，美國(guó)）；RS-232紫外分光光度計(jì)Eppendor f公司，德國(guó)；NU一4950E三氣培養(yǎng)箱：（NUAIRE公司，美國(guó)）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1采樣

胃粘膜標(biāo)本的采集：延邊大學(xué)附屬醫(yī)院胃鏡室里取樣，確診感染幽門螺桿菌的未任何藥物治療患者 經(jīng)志愿者同意采樣的情況下，在纖維內(nèi)鏡檢查的同時(shí)用活檢鉗在距幽門口的胃感染竇部3、6、9、12點(diǎn)處鉗取4份胃粘膜組織后涂布哥倫比亞培養(yǎng)基(含幽門螺桿菌添加劑)上，置密封罐中加入微需氧產(chǎn)氣袋(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)保管，移放已調(diào)好37℃含(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)，濕度為80%厭氧細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天.

2.2培養(yǎng)

在37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)出來的菌落，按照菌落模樣、大小、顏色等逐一分類.各取4份涂抹在哥倫比亞培養(yǎng)基(含幽門螺桿菌添加劑)上，調(diào)好37℃含(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)濕度為80%厭氧細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天.從各個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上取一個(gè)單獨(dú)的菌落，放入3ml營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nut rient broth），在37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱里培養(yǎng)3天.

2.3分離

利用paper point采培養(yǎng)皿上的細(xì)菌，放在1 ml的1X PBS緩沖溶液移置在厭氧培養(yǎng)室里1000倍稀釋之后，均勻涂在含哥倫比亞瓊脂的固體培養(yǎng)基里（Columbia agar base or brain heart infusion)+4%horse blood+抗生素［(Hel icobacter pylori selective supplement,SR147E,Oxoid)］、Brucel la broth 28g+Agar 15g+Skir row′s supplement 2ml/l iter+5%horse serum、Skirrow′s supplement、8mg的多粘菌素B加250mg的萬古霉素 和125mg的甲氧芐氨嘧啶、Brucel la agar+Fungi zone 2ml+5%horse serum）.

在37℃(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)混合氣體的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)5天.觀察5天，培養(yǎng)基上挑出針尖樣、半透明的、散在的菌落用消毒后的接種環(huán)刮取菌落，將其接種到pet ri dishi(90╳15nm)平皿上37℃(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)培養(yǎng)4天.

3 鑒定

3.1幽門螺桿菌的快速尿素酶試驗(yàn)：

自制快速尿素酶液(取尿素20g,加二重蒸餾水200ml,過濾后加入0.4%酚紅8ml)配成尿素酚溶液.eppendor f f tube管加入300ul尿素酚和150ul幽門螺桿菌培養(yǎng)液混勻后放置3分鐘后觀察顏色變化.顏色變?yōu)榧t色為陽性,不變色者為陰性。

3.2分子生物學(xué)方法鑒定

3.2.1細(xì)菌基因組DNA提?。?/p>

哥倫比亞瓊脂的固體培養(yǎng)基里培養(yǎng)出來的菌落，放在TH broth里細(xì)菌培養(yǎng)液，使用G-spin Gemonic DNA Extraction Kit(iNtRON Inc.,Seoul,Korea)提取質(zhì)粒DNA。操作如下：把1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)液放到eppendor f f tube管12000 rpm離心1分鐘，生成細(xì)菌沉淀結(jié)晶。放入50μl Pre-buf fer和3μl Lysozyme溶液混勻，放置37℃恒溫箱里1小時(shí)之后，加入250μl G-buf fer混勻，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15分鐘，加入250μl Binding solution混勻，移到Spin column，離心12000rpm 1分鐘 棄去過濾液，把500μl Washing buf fer A放在column離心12000rpm 1分鐘，棄去過濾液，把500μl Washing buf fer B放在column離心12000rpm 1分鐘，棄去過濾液，把column移到新的eppendor f f tube上，加入100μl Elution buf fer離心12000rpm 1分鐘 棄去column后保管基因組DNA，用于聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)（PCR）

3.2.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：

使用通用引物27F;5'-AGAGTTTGATC[A/C]TGGCTCAG-3',1492R;5'-TACGG[C/T]TACCTTGTTACGACTT-3'),AccuPower Premix (Bioneer Corp.) 和PTC-200 (MJ Research Inc.,Water town,MA,USA)PCRmachine擴(kuò)增16S rDNA。最終反應(yīng)產(chǎn)物取2ul在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳1hr，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

3.2.3克隆并提取質(zhì)粒DNA

按照制造公司操作說明進(jìn)行：pEZ-T easy vector(RNA Corp.,Seoul,Korea)克隆。擴(kuò)增的16S rRDA遺傳基因，挑出70-80個(gè)鑲?cè)脒z傳基因的白色菌落，放入5ml LB broth 37℃震蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2天，通過alkaline lysis法 按照制造公司AccuPrepTM Plasmid Ext raction Kit (Bioneer Corp.,Seoul,Korea)要求提取質(zhì)粒，通過1.0%瓊脂糖凝膠中電泳1hr，在紫外燈下觀察鑲?cè)隓NA結(jié)果。

3.2.4質(zhì)粒DNA提?。?/p>

通過E.coli DH5α t ransformation的各個(gè)重組質(zhì)粒DNA用alkal ine lysis方法AccuPrepTM Plasmid Ext raction Kit(Bioneer Corp.,Seoul,Korea)要求提取質(zhì)DNA。

3.2.5.核酸堿基序列解讀：

利用通用引物（Seq-F2(5'-ggA TTA gAT ACC CTg g-3')聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增rDNA，送到Bioneer公司進(jìn)行分析.反饋的結(jié)果使用SeqMAN(Version 5.00；DNASTAR,Inc,Madison,WI,USA)系統(tǒng)分析，利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，相關(guān)性99%以上致病菌判定是同一種細(xì)菌種屬。

4 結(jié)果

4.1分離培養(yǎng)的幽門螺桿菌（圖1）；

4.2利用自制幽門螺桿菌尿素酶快速診斷試劑紙其觀察結(jié)果：試劑紙變?yōu)榧t色，表明尿素酶試驗(yàn)呈陽性（圖2）；

4.3 1.0%瓊脂糖凝膠中電泳375bp出現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶（圖3）；

4.4利用GenBank等數(shù)據(jù)庫比較核酸堿基序列相同性99%以上，可以判定是同一種屬的細(xì)菌（圖4）.

結(jié)論：

16S rRNA gene(16S rDNA)核酸堿基序列比較分析法，經(jīng)過16S rDNA PCR擴(kuò)增、復(fù)制、核酸堿基序列鑒定99%相同性，判定是幽門螺桿菌的同一種屬細(xì)菌.今后收集和整理延邊醫(yī)院治療前后細(xì)菌菌株分類和分布，并構(gòu)建幽門螺桿菌數(shù)據(jù)庫建設(shè)提科學(xué)的依據(jù)。

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圖2：鑒定并委托Bioneer公司 進(jìn)行分析，反饋的結(jié)果，利用GenBank等數(shù)進(jìn)行核算堿基序列比較98%相同性，判定同一種屬細(xì)菌