潘啟敏 孫曉琳

（1.甘肅省金昌市金川區(qū)農(nóng)牧局 甘肅 金昌 737100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅 蘭州 730000）

巴斯德菌科(Past teurel laceae)嗜血桿菌屬(Haemophi lus）的副豬嗜血桿菌(H-aemophilus parasuis,Hps)作為豬的上呼吸道條件致病菌所引起的豬的以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎、高發(fā)病率、高死亡率為特征的革拉瑟氏病(Glasser’s disease）對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的威脅[1]。本病已經(jīng)逐漸演變?yōu)槭澜绶秶鷥?nèi)流行的重要疾病，由于飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和環(huán)境衛(wèi)生等因素的影響，金昌市金川區(qū)某一大型養(yǎng)殖場(chǎng)也發(fā)生了本病。

1 材料與方法

1.1病料來(lái)源

金昌市金川區(qū)某一大型養(yǎng)殖場(chǎng)共養(yǎng)殖267頭豬，于2013年8月21日到8月29，4圈60頭的豬舍每圈平均每天發(fā)病3只，平均發(fā)病率為4.49%，死亡率3.37%。病豬的主要臨床癥狀為：出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、跛行、發(fā)病率和死亡率極高，無(wú)菌采集病死豬的肺臟、胸腔積液、關(guān)節(jié)滑液置于滅菌容器中，迅速送實(shí)驗(yàn)室并盡快進(jìn)行病原分離。

1.2培養(yǎng)基

加入5%小牛血清和1%NAD的TSA平板、5%的綿羊鮮血瓊脂平板、TSB液體培養(yǎng)。

1.3方法

（1）病原分離：無(wú)菌條件下將疑似豬采集的肺臟和關(guān)節(jié)滑液接種在TSA和血平板上，37℃培養(yǎng)24～48h后挑取大量生長(zhǎng)的單個(gè)菌落再進(jìn)行純培養(yǎng)。

（2）染色鏡檢：將上述采集的病料組織進(jìn)行抹片鏡檢，將純培養(yǎng)的菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。

（3）生化鑒定：無(wú)菌條件下挑取可疑單個(gè)菌落，劃直線接種在無(wú)NAD添加的綿羊鮮血平板上，再垂直劃線接種金黃色葡萄球菌，37℃培養(yǎng)24～48h觀察有無(wú)“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”，將生長(zhǎng)出來(lái)沒(méi)有溶血的菌落純培養(yǎng)后接種于各種碳水化合物、尿素酶、糖苷等微型生化鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司）中，37℃培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果，同時(shí)做氧化酶和接觸酶實(shí)驗(yàn)。

（4）藥物敏感實(shí)驗(yàn)：將鑒定確認(rèn)后的副豬嗜血桿菌做37℃液體培養(yǎng)12h，按常規(guī)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。無(wú)菌吸取疑似多殺性巴氏桿菌菌液200μL，用火焰滅菌后的L玻璃棒反復(fù)均勻地涂布于TSA培養(yǎng)基上，待干燥后選用CEF、CIP、LEV、ENO、AZM、FLO、TET、TMP、AMX、CEC、TIA、TIL、SPE、PEN、CTX、CHL、STR、KAN、GEN、

ERY等藥敏紙片（包含各類抗菌藥）等距離(1.5cm)壓放在培養(yǎng)基表面。置于37℃培養(yǎng)18～24h取出，觀察抑菌圈直徑大小并記錄結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)為藥物敏感試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)（WS/T125-1999），即抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，直徑在10～15mm為中度敏感，直徑大于15mm以上為高度敏感。

2 結(jié)果

此次實(shí)驗(yàn)總共采集4份組織病料，分離出1株革蘭氏陰性絲狀桿菌，其細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)結(jié)果如下。

2.1菌落和細(xì)菌形態(tài)：培養(yǎng)后在TSA平板上生長(zhǎng)出針尖大小、無(wú)色透明、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的小菌落，涂片染色鏡檢后在顯微鏡下觀察到革蘭氏陰性絲狀的菌體。

2.2生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在綿羊血平板上上劃線交叉的地方生長(zhǎng)出了一些小菌落，不產(chǎn)生溶血，遠(yuǎn)離交叉點(diǎn)菌落生長(zhǎng)越少，其他生化鑒定的結(jié)果見表1。

2.3藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果：藥物敏感實(shí)驗(yàn)見表2。斷方法就是細(xì)菌分離鑒定，因?yàn)楸揪惓４嗳?，在外界環(huán)境中最多存活24h，因此分離時(shí)需要注意病料的新鮮性，本實(shí)驗(yàn)分離出的細(xì)菌從菌落形態(tài)、染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化實(shí)驗(yàn)等方面結(jié)果都符合HPS的特性[3,4]。

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，此次分離出的副豬嗜血桿菌對(duì)慶大霉素、先鋒霉素Ⅳ、氨芐舒巴坦、阿米卡星、氯霉素的敏感性較高，根據(jù)研究報(bào)道HPS對(duì)氯霉素的敏感性由2002年的97.3%上升到2008年的100%，該結(jié)果可能與氯霉素禁用于動(dòng)物性食品的國(guó)家禁令有關(guān)；對(duì)恩諾殺星的敏感度較低是由于這種廣譜抗生素被不規(guī)范的應(yīng)用于豬病的預(yù)防和治療中。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)多種藥物系統(tǒng)的研究了金昌市金川區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的耐藥性，為臨床用藥提供比較詳實(shí)準(zhǔn)確的參考，具有很大的應(yīng)用意義。在這基礎(chǔ)上還是要求持續(xù)監(jiān)測(cè)本地區(qū)的副豬嗜血桿菌病，實(shí)施科學(xué)規(guī)范的抗生素使用，以防耐藥菌株的產(chǎn)生[5]。

3 討論

副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)依賴V因子即NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），因此在培養(yǎng)分離時(shí)必須添加NAD，細(xì)菌在綿羊鮮血平板上生長(zhǎng)后不具有溶血性，因此“衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)”可作為鑒定的依據(jù)[2]。由于其臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)特點(diǎn)與鏈球菌病、支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎很接近，因此目前比較理想的臨床診

[1]蔡旭旺.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:18-20.

[2]華生,梅書棋,曾德芳等.副豬嗜血桿菌研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(11):107-110.

[3]吳娟.副豬嗜血桿菌突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:25.

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