任 菊 ，郝華山 ，王明奎

（1、涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅武威733000；2、涼州區(qū)柏樹(shù)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，甘肅武威733000）

1 材料和方法

1.1主要材料及試劑

1.1.1血清樣品 從2012年至2014年，采集涼州區(qū)135個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)血清4061份，其中2012年1345份，2013年1380份，2014年1425份，用于豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎免疫抗體檢測(cè)，豬偽狂犬病可檢測(cè)野毒感染。

1.1.2主要試劑

豬瘟正向間接血凝檢測(cè)試劑盒（蘭州獸研所生產(chǎn)），豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病毒抗體檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒抗體檢測(cè)試劑盒、豬乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒（均由深圳芬德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.1.3主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、微量移液器、低速大容量多管離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、純水機(jī)、無(wú)菌采血器、離心管。

1.2方法

1.2.1采樣仔豬、保育豬采用前腔靜脈采血法采集血液，育肥豬、母豬、公豬采用耳靜脈采血法采集血液。

1.2.2血清的分離

無(wú)菌采血器或真空采血管采集血液樣本3～5ml，室溫靜置2～4h或經(jīng)3000r/min離心析出血清，取上清液置于滅菌的離心管內(nèi)，逐份進(jìn)行編號(hào)。血清樣本經(jīng)56℃30min滅活后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)

按豬瘟正向間接血凝檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)：在96孔110°V型微量血凝板上加稀釋液50ul,再加待檢血清、陰陽(yáng)性血清50ul，對(duì)倍稀釋待檢血清、陰陽(yáng)性血清，加血凝抗原25ul（充分搖勻瓶底應(yīng)無(wú)紅細(xì)胞沉淀），血凝板置于微量振蕩器上振蕩2～3分鐘，然后蓋上玻璃板，室溫下或37℃下靜置1.5-2小時(shí)判定結(jié)果，也可放在室溫下延至翌日判定。陰陽(yáng)性對(duì)照成立的條件下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。接種豬瘟兔化弱毒疫苗的豬群免疫抗體效價(jià)達(dá)到1:32及以上（即第5孔呈現(xiàn)出“++”凝集）為免疫合格。

1.2.4豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬、豬細(xì)小病毒、乙型腦炎ELISA試驗(yàn)

按豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬、豬細(xì)小病毒、乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)：待檢血清1:40稀釋，加入抗原包被板中，經(jīng)37℃溫育半小時(shí)，洗板后加入酶標(biāo)二抗，37℃溫育半小時(shí)，洗板加入底物，37℃溫育10分鐘后，加入終止液，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。在陰陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，按公式S/P=樣品孔A值/陽(yáng)性對(duì)照孔平均A值計(jì)算，S/P≥0.18為陽(yáng)性，S/P＜0.15為陰性，0.15≤S/P＜0.18為可疑。

1.2.5豬偽狂犬病gE抗體檢測(cè)試驗(yàn)

按豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)：

待檢血清1:100稀釋，加入抗原包被板中，經(jīng)37℃溫育半小時(shí)，洗板后加入酶標(biāo)二抗，37℃溫育半小時(shí)，洗板加入底物，37℃溫育10分鐘后，加入終止液，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。在陰性對(duì)照≤0.10，陽(yáng)性對(duì)照≥0.6的情況下，樣品A值≥0.38為陽(yáng)性；樣品A值在0.2到0.38之間為可疑；樣品A值＜0.2為陰性。

2 結(jié)果

三年共檢測(cè)血清6990份（次），平均抗體合格率分別為：豬瘟85.33%、豬繁殖和呼吸綜合征84.96%、細(xì)小病毒病81.46%、乙型腦炎83.68%，這5中疫病免疫抗體合格率均達(dá)到國(guó)家農(nóng)業(yè)部規(guī)定的70%以上。豬偽狂犬病野毒感染率分別為：2012年18.7%，2013年8.6%，2014年為0.3%。（見(jiàn)表1）

3 小結(jié)與討論

（1）通過(guò)免疫抗體效果監(jiān)測(cè)可以看出，我區(qū)規(guī)模場(chǎng)豬繁殖障礙性疫病通過(guò)三年的疫苗免疫，防控達(dá)到了一定的效果，抗體水平有逐年上升的趨勢(shì)，疫苗免疫抗體合格率比防控前明顯提高，表明了我區(qū)規(guī)模場(chǎng)豬繁殖障礙性疫病得到有效遏制，疫病凈化工作已見(jiàn)成效。

（2）及時(shí)了解繁殖障礙性疫病免疫抗體水平，可及時(shí)調(diào)整規(guī)模場(chǎng)免疫程序，確定合理的免疫時(shí)間，達(dá)到預(yù)期的免疫效果。規(guī)模場(chǎng)應(yīng)用偽狂犬病基因缺失苗免疫，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法可檢測(cè)野毒感染豬，從表1檢測(cè)結(jié)果可知，2012年豬偽狂犬野毒感染率為18.7%，2013年感染率為8.6%， 2014年感染率為0.3%，比防控前2011年32.41%，下降了32.01個(gè)百分點(diǎn)，豬偽狂犬病在我區(qū)的規(guī)模場(chǎng)已基本得到控制和凈化。

（3）豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒、乙型腦炎疫苗免疫抗體常年保持在75%以上，表明了項(xiàng)目組制定的免疫程序（豬瘟免疫：仔豬20-24日齡首免4頭份、60日齡二次免疫2頭份，種豬2月、6月、10月各免疫1次，2頭份；豬藍(lán)耳病免疫：仔豬45日齡2ml，母豬產(chǎn)前50天免疫1次、4ml，公豬每年2次、每次4ml；豬偽狂犬免疫（偽狂犬基因缺失苗）：仔豬50日齡免疫1次、1頭份，母豬產(chǎn)前40天免疫1次、2頭份，公豬每年2次、每次2頭份；豬細(xì)小病毒免疫：母豬配種前30天免疫1次、2ml，公豬每年2次、每次2ml；豬乙型腦炎免疫：種豬每年4月份免疫1次、1頭份），適合涼州區(qū)規(guī)模場(chǎng)豬繁殖障礙性疫病的預(yù)防，防控效果顯著。