徐春芳

（青海省海東市畜牧獸醫(yī)工作站，810600）

隨著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的日益規(guī)模化，豬腹瀉性傳染病的流行日益增多，尤其自2010年下半年以來，我國養(yǎng)豬密集地區(qū)由南方至北方相繼暴發(fā)了以新生仔豬高發(fā)病率、高死亡率、現(xiàn)有疫苗與藥物防治效果均不理想為主要特征的腹瀉性疫病[1.2]，給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。導(dǎo)致生豬腹瀉性傳染病的病因極其復(fù)雜，主要有病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、寄生蟲性腹瀉以及營養(yǎng)性腹瀉等[3]，且常?；旌细腥?，混合感染的傷害更為嚴(yán)重，通常具有更高的致病性和死亡率[4]，較難控制。本研究對青海省某養(yǎng)殖場腹瀉仔豬進(jìn)行臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室PCR確診，最后確診為由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diar rhea virus，PEDV）、 豬 傳 染 性 胃 腸 炎 病 毒（Transmissible gast roenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（rotavirus，RV）3種病毒混合感染所致，為該養(yǎng)殖場和該地區(qū)豬腹瀉性傳染病的綜合防控提供了基本資料信息?，F(xiàn)將診斷過程報(bào)告如下：

1 臨床診斷

1.1發(fā)病情況 2013年11月，青海省某養(yǎng)豬場哺乳仔豬發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，發(fā)病率在80%以上，死亡率約為70%。該場未進(jìn)行豬病毒性腹瀉疫苗的免疫接種，發(fā)病后曾用鏈霉素、青霉素、磺胺類等抗生素類藥物進(jìn)行治療，無任何效果。

1.2臨床癥狀 臨床表現(xiàn)為精神萎頓，厭食、嘔吐、排水樣糞便，最后因機(jī)體脫水、消瘦、衰竭而死亡。

1.3病理變化 對病死豬進(jìn)行剖檢，可見胃黏膜有出血點(diǎn)，胃內(nèi)充滿凝乳塊，腸管膨脹擴(kuò)張，腸壁變薄，呈半透明狀，腸內(nèi)容物呈黃色泡沫狀，腸淋巴結(jié)充血、水腫，腎臟變性。

1.4臨床診斷結(jié)果 通過以上發(fā)病特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化及流行病學(xué)資料初步判定該場為豬病毒性腹瀉，但究竟由哪種或哪幾種病毒感染引起，還無法確定。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1病料的采集與樣品處理 盡量無菌采集病死豬小腸、腸黏膜及淋巴結(jié)，低溫、迅速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。將采集的組織病料與5倍體積滅菌生理鹽水充分混合、碾磨、勻漿，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2試驗(yàn)所需主要試劑Trizol、DL 2000 Marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司；一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑。

2.3設(shè)計(jì)合成引物 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)針對PEDV、TGEV、RV的特異性檢測引物，詳見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1引物信息表

2.4RNA的提取 取組織樣品上清液200μL，加Trizol試劑600μL充分混合后室溫靜止5min，加氯仿200μL充分混合后室溫靜止5min，12000 r/min離心10 min，取上清液加入等量異丙醇，輕輕混合均勻，室溫靜止10 min，12000r/min離心10 min，棄上清液，加入1mL70%無水乙醇，12000r/min離心5 min，棄上清液，沉淀溶解于20μL無Rnase水中，即得

2.5RT-PCR擴(kuò)增 以提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增體系為25μL，含2×Buf fer 12.5μL、酶1μL、上下游引物各0.5μL、RNA 5μL、水5.5μL。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃1h；94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min。2.6RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如圖1所示，PEDV、TGEV、RV均為陽性。

3 診斷結(jié)論

經(jīng)臨床診斷確定為仔豬病毒性腹瀉，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確定為由PEDV、TGEV、RV 3種病毒混合感染所致，但究竟是3種病毒中的1種病毒在致病過程中起到了決定性作用，還是3種病毒協(xié)同起到了致病作用，有待進(jìn)一步研究。

4 討論

近年來，因豬病毒性腹瀉引起的仔豬死亡日益增多，豬病毒性腹瀉的危害日益嚴(yán)重。郭旋等[1]對2011～2012年廣西11個城市232份病料進(jìn)行PEDV、TGEV、RV的流行病學(xué)調(diào)查，PEDV、RV、TGEV的陽性率分別為37.50%、0.03%、0%，劉云波等[2]對2011～2012年國內(nèi)13個省市的豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測，TGEV、PEDV、RV陽性率分別為2.65%、24.49%、3.20%。魏海芳等[6]對青海省60份腹瀉臨床病料進(jìn)行PEDV、TGEV、RV的檢測與分析，PEDV、RV和TGEV的陽性率分別為76.7%、51.7%和30.0%，PEDV/RV、PEDV/TGEV、PEDV/RV/TGEV的混感率分別為23.33%、8.33%、51.67%，不存在RV/TGEV混感型。豬病毒性腹瀉病毒在我國已具有非常高的感染率，呈全國性散發(fā)性流行，其中以PEDV的感染最為突出，感染率最高，且PEDV與RV、TGEV的混合感染比較普遍，給臨床診斷和預(yù)防控制增加了難度，這就要求臨床獸醫(yī)在確診PEDV感染的同時，還應(yīng)重點(diǎn)考慮是否存在TGEV或RV的混合感染。

豬病毒性腹瀉對仔豬的危害嚴(yán)重，病死率非常高，豬即使耐過存活，康復(fù)后仍然生長緩慢，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。而目前，PEDV與RV、TGEV的混合感染使仔豬病毒性腹瀉更加難以控制，本病例實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果為PEDV、TGEV、RV 3種病毒混合感染，這在仔豬病毒性腹瀉病例中具有十分典型的代表性。因PCR分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有敏感、特異、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，且能夠檢測到特定病原體特定的核苷酸序列，具有常規(guī)診斷方法無法比擬的準(zhǔn)確性，故本病例采用PCR技術(shù)作為確診的工具，增加了診斷結(jié)果的可靠性。但本病例究竟是由3種病毒中的1種病毒所致，還是3種病毒協(xié)同起到了致病作用，有待病毒分離和致病性試驗(yàn)等更進(jìn)一步研究。

[1]郭旋,陳靜,劉歡,等.廣西仔豬腹瀉病毒病原流行病學(xué)調(diào)查[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,44(1):155-160.

[2]劉云波,趙洪翠,王志成,等.豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(2):204-207.

[3]程忠軍.導(dǎo)致豬腹瀉的常見原因與應(yīng)對措施[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,19(13):137-138.

[4]SongDS,KangBK,OhJS,etal.Mul tiplexreversetranscription-PCR for rapid di f ferential detection of porcine epidemic diar rhea virus,transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus[J].JVet Diagn Invest,2006,18(3):278-281.

[5]張坤,何啟蓋.豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,41(8):1001-1005.

[6]魏海芳,王鴻忠.青海省部分地區(qū)PEDV、TGEV和RV感染情況調(diào)查與分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(9):133-136.