李 雄，雷 虹，龍 云，李昊幫，李劍波，羅 希，李 晟，燕海峰，易康樂*

(1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所 草業(yè)與草食動(dòng)物研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2. 湖南德農(nóng)牧業(yè)科技有限公司，湖南 花垣 416400；3.長(zhǎng)沙千山畜牧服務(wù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410144)

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湘西黃牛發(fā)情周期與妊娠早期孕酮變化規(guī)律研究

李 雄1，雷 虹1，龍 云2，李昊幫1，李劍波1，羅 希3，李 晟1，燕海峰1，易康樂1*

(1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所 草業(yè)與草食動(dòng)物研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2. 湖南德農(nóng)牧業(yè)科技有限公司，湖南 花垣 416400；3.長(zhǎng)沙千山畜牧服務(wù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410144)

采集湘西黃牛母牛的血液樣品，通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)和比較其在發(fā)情周期和早期妊娠期的孕酮(P4)水平。結(jié)果表明，湘西黃牛的發(fā)情周期中， P4濃度變化非常明顯, 大致呈先上升再下降的趨勢(shì)。發(fā)情前期、中期、后期和間情期P4濃度分別為8.85、0.72、1.40和9.13 ng/mL，發(fā)情中期與后期P4濃度顯著低于發(fā)情前期和間情期(P<0.05)；妊娠早期的母牛，從發(fā)情配種后，血液中P4濃度緩慢升高，其中妊娠后0～10 d、11～20 d、21～30 d和31～36 d P4濃度分別為3.36、8.91、12.69和16.12 ng/mL，各階段P4濃度差異顯著(P<0.05)；發(fā)情后第21 d 、24 d、27 d和30 d，妊娠母牛血液中的P4濃度顯著高于未妊娠的母牛(P<0.05)。試驗(yàn)表明，發(fā)情配種后20 d，妊娠母牛與未妊娠母牛的血液中孕酮含量差異明顯，可作為判斷是否受孕的標(biāo)記因子。

湘西黃牛；妊娠早期；發(fā)情周期；孕酮

雌性動(dòng)物的發(fā)情周期與妊娠主要受到神經(jīng)和激素的雙重調(diào)節(jié)。生殖激素作用調(diào)節(jié)生殖、妊娠全過程。研究發(fā)情周期和妊娠周期中生殖激素的變化情況對(duì)動(dòng)物發(fā)情和妊娠周期的調(diào)控機(jī)制、預(yù)防和治療生殖類疾病、提高受胎率和妊娠率等方面有很大幫助。在母牛生殖激素研究方面，研究的重點(diǎn)是雌激素(E2)、孕酮(P4)、促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)。這些激素與母牛的正常發(fā)情、排卵、受孕、妊娠等生殖活動(dòng)密切相關(guān)。一般情況下，母牛發(fā)情周期中 LH濃度出現(xiàn)兩個(gè)高峰。第一個(gè)小高峰出現(xiàn)在發(fā)情當(dāng)天，第二個(gè)高峰出現(xiàn)排卵期左右。E2水平在整個(gè)發(fā)情周期內(nèi)變化相對(duì)平緩。而P4濃度變化大致呈先上升再下降的趨勢(shì)，具有非常明顯的規(guī)律性[1]。因此，將P4作為母牛早期妊娠診斷的標(biāo)記因子在理論上是可行的。

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已普遍應(yīng)用孕酮檢測(cè)技術(shù)來監(jiān)測(cè)家畜動(dòng)物的繁殖與妊娠情況[2-4]。但肉牛與奶牛的發(fā)情周期內(nèi)孕酮表達(dá)水平差異很大，國(guó)內(nèi)黃牛品種與國(guó)外良種肉牛品種也有差異[5-7]。針對(duì)地方肉牛品種的相關(guān)研究報(bào)道較少，對(duì)湘西黃牛本研究旨在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)湘西黃牛血液中孕酮含量進(jìn)行測(cè)定研究，掌握湘西黃牛孕酮在體內(nèi)變化規(guī)律，了解其生殖生理變化規(guī)律，為湘西黃牛早期妊娠診斷及其它繁殖狀態(tài)的監(jiān)控提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

確定湖南德農(nóng)牧業(yè)科技有限公司湘西黃牛資源場(chǎng)內(nèi)的湘西黃牛母牛為試驗(yàn)牛，并隨機(jī)選擇膘情適中、生殖機(jī)能正常且正處于發(fā)情期的15頭母牛，對(duì)發(fā)情爬跨牛進(jìn)行直檢，觸摸卵泡發(fā)育及排卵情況，以母牛接受爬跨，有成熟卵泡視為發(fā)情。對(duì)其中5頭母牛進(jìn)行適時(shí)配種。

1.2 采樣方法與數(shù)量

對(duì)發(fā)情期內(nèi)不同時(shí)間段的肉牛血液進(jìn)行采集，采血液 10 mL。自母牛發(fā)情當(dāng)天開始至第36天止，發(fā)情當(dāng)天即為0 d，每隔3 d采集血樣。

1.3 血清處理

所得離心管中的血液經(jīng)室溫靜置 4 h 后，在 4 ℃冰箱中保存過夜，待血清析出后，以 1000×g 離心 20 min，吸取血清，置于 1.5 mL 離心管中，再用同一轉(zhuǎn)速將分離到的血清離心 20 min，棄去沉淀, 分裝標(biāo)號(hào)-80 ℃保存待用。避免反復(fù)凍融。

1.4 早期妊娠檢查

配種60 d后，利用超聲波技術(shù)(B型超聲波診斷儀VGS3000，成都偉格科技有限公司)對(duì)配種母牛進(jìn)行直腸內(nèi)檢查，判斷是否妊娠。

1.5 試驗(yàn)樣品激素的測(cè)定

將以上處理好的樣品，利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)采集的整個(gè)發(fā)情期內(nèi)血清中P4含量的變化規(guī)律，在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所草業(yè)草食動(dòng)物研究室生理生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，所用P4ELISA 試劑盒武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示，采用生物統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行處理分析。均值顯著性分析采用Duncan法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情周期中不同階段孕酮水平檢測(cè)

由表1知，在湘西黃牛整個(gè)發(fā)情周期中，發(fā)情前期的P4濃度為8.85 ng/mL，發(fā)情中期的P4濃度為0.72 ng/mL，發(fā)情后期的P4濃度為1.4 ng/mL，間情期的P4濃度為9.13 ng/mL。其中發(fā)情中期與后期P4濃度差異不顯著(P>0.05)，發(fā)情前期和間情期P4濃度差異不顯著(P>0.05)，發(fā)情中期與后期P4濃度顯著低于發(fā)情前期和間情期(P<0.05)。

2.2 妊娠早期孕酮水平檢測(cè)

由表2知，在妊娠早期的湘西黃牛母牛，從發(fā)情配種后，0～10 d，P4濃度為3.36 ng/mL；11～20 d，P4濃度為8.91 ng/mL；21～30 d，P4濃度為12.69 ng/mL；31～36 d，P4濃度為16.12 ng/mL。各階段P4濃度差異顯著(P<0.05)。

表1 湘西黃牛母牛發(fā)情周期血液中孕酮水平Table 1 Concentration of progesterone in female Xiangxi cattle estrus cycle

注：同行肩標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes:Means with lowercase superscripts in the same row indicate significant difference(P<0.05).The same as below.

表2 湘西黃牛母牛妊娠早期血液中孕酮水平Table 2 Concentration of progesterone in female Xiangxi cattle estrus cycle

2.3 孕酮水平的變化規(guī)律

由圖1知，在湘西黃牛整個(gè)發(fā)情周期中，P4濃度變化非常明顯。大致呈先上升再下降的趨勢(shì)。發(fā)情當(dāng)天，P4濃度最低，為 0.36 ng/mL。然后顯著上升，第12天達(dá)到最高值14.85 ng/mL。隨后快速下降，至發(fā)情前期，回落到1.00 ng/mL左右。第24天后，P4濃度又逐步升高。妊娠早期的母牛，從發(fā)情配種后，血液中P4濃度緩慢升高。第21天時(shí)，為11.10 ng/mL，第36天時(shí)，達(dá)到16.38 ng/mL。

由圖2可知，發(fā)情后第21天 、24天、27天和30天，妊娠母牛血液中的P4濃度依次為11.10 ng/mL、12.32 ng/mL、13.05 ng/mL和14.29 ng/mL，顯著高于未妊娠的母牛血液中的對(duì)應(yīng)濃度1.07 ng/mL、0.67 ng/mL、2.45 ng/mL和7.12 ng/mL(P<0.05)。

圖1 血清中孕酮水平變化曲線Fig.1 Serum progesterone variation curve in Xiangxi cattle

圖2 發(fā)情后21～30 d血清中孕酮水平比較Fig.2 Serum hormone levels comparison in 21～30 d after estrus

3 討 論

3.1 湘西黃牛發(fā)情周期血液中孕酮水平變化

一般而言，母牛在發(fā)情排卵后，在LH的作用下，顆粒細(xì)胞黃體化形成黃體組織，孕酮分泌量逐步增加。一般在排卵后的8 d～10 d(發(fā)情后的10～12 d)，血液中孕酮濃度會(huì)達(dá)到一個(gè)峰值。此后，由于FSH的作用，周期性黃體開始退化，孕酮水平逐漸下降。在排卵前后達(dá)到一個(gè)最低閾值[8-10]。在本研究中，湘西黃牛母牛血液中孕酮水平大致符合這一規(guī)律。在發(fā)情當(dāng)天，孕酮水平平均達(dá)到0.36 ng/mL，發(fā)情后12 d達(dá)到14.85 ng/mL。但是從檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，發(fā)情間期孕酮最大值達(dá)到了14.85 ng/mL，要高于王宏娟報(bào)道的荷斯坦奶牛、西門塔爾牛[11]，與謝炳坤報(bào)道的廣西本地黃牛水平接近[12]。這可能是本研究所用的試驗(yàn)動(dòng)物全程采取放養(yǎng)或半放養(yǎng)模式造成的。在全舍飼養(yǎng)殖模式下，母牛每日采食的精料可能較多，攝入的蛋白能量水平較高。高蛋白飼料的攝取，會(huì)造成母牛體內(nèi)尿素氮和其它氮代謝產(chǎn)物濃度升高。高濃度的尿素氮將阻礙促黃體素與卵巢組織上特異性受體的結(jié)合，導(dǎo)致體內(nèi)孕酮含量降低。而其它的氮代謝產(chǎn)物具有一定的毒性，可能會(huì)降低機(jī)體對(duì)能量的利用率，阻礙孕酮的分泌[13]。自然放牧或半放養(yǎng)狀態(tài)下母牛主要以青綠飼草為主，所以母牛血清中孕酮水平可能更高。

3.2 湘西黃牛妊娠早期血液中孕酮水平變化

在母牛受孕后，形成妊娠黃體。妊娠早期的黃體細(xì)胞、中后期的胎盤都會(huì)產(chǎn)生孕酮。孕酮主要作用于子宮，抑制子宮內(nèi)膜和子宮肌收縮，維持孕卵著床和妊娠過程。一般從妊娠后血液中孕酮的水平會(huì)持續(xù)升高，直至臨產(chǎn)前差下降[14-16]。在本研究中，在湘西黃牛母牛妊娠早期，血液中的孕酮含量持續(xù)升高，每個(gè)階段的水平量差異顯著。在第36 d，達(dá)到了達(dá)到16.38 ng/mL。

3.3 孕酮作為早孕標(biāo)記因子的可行性

湘西黃牛是巫陵牛的一個(gè)品系，屬役肉兼用型牛，主產(chǎn)于湖南省湘西土家族苗族自治州以及桑植、慈利、石門、新晃、芷江、麻陽(yáng)、桃源等縣部分地區(qū)，湘西黃牛是我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)所有地方品種中個(gè)體最大、適應(yīng)能力強(qiáng)、早熟、產(chǎn)仔性能好、生長(zhǎng)速度較快、肉質(zhì)味美、皮張質(zhì)地好的優(yōu)勢(shì)資源[17]。從20世紀(jì)80年代開始，由于沒有科學(xué)的選種選配，近親交配現(xiàn)象普遍存在，致使湘西黃牛品種嚴(yán)重退化。因此，湘西黃牛的品種提純復(fù)壯和快速擴(kuò)繁工作顯現(xiàn)十分緊迫。而湖南省的肉牛業(yè)生產(chǎn)水平還很低，剛剛開始由傳統(tǒng)的耕牛飼養(yǎng)向現(xiàn)代肉牛業(yè)轉(zhuǎn)型，還沒有形成真正意義上的肉牛業(yè)，在發(fā)展過程中還存在著許多問題。在實(shí)際的肉牛養(yǎng)殖中，由于失配、誤配、胚胎早期死亡(流產(chǎn))和屢配不孕等原因，造成了我省大量能繁母牛的空懷期延長(zhǎng)，降低母牛的繁殖率和利用效率，從而嚴(yán)重阻礙湖南省肉牛業(yè)的發(fā)展[18-19]。因此，本研究通過研究湘西黃牛孕酮體內(nèi)變化情況了解其生殖生理變化規(guī)律，為湘西黃牛早期妊娠診斷及其它繁殖狀態(tài)的監(jiān)控提供可靠數(shù)據(jù)。

通過對(duì)湘西黃牛母牛血液中P4含量的跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)情后第21天 后，妊娠母牛血液和尿液中的P4濃度顯著高于未妊娠母牛(P<0.05)。說明P4可以作為一個(gè)判斷湘西黃牛早期妊娠的一個(gè)標(biāo)記因子應(yīng)用母牛的早期妊娠診斷[18]。

但在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)湘西黃牛妊娠母牛在自然發(fā)情未孕過程中，血液中的P4濃度最高值超過了10 ng/mL，顯著高于其它大型牛品種[11,20-21]。而現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的以孕酮為標(biāo)記的早孕檢測(cè)試紙條的閾值為10 ng/mL。因此，采用現(xiàn)有的成品早孕檢測(cè)試紙條檢測(cè)湘西黃牛配種母牛，極容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而影響母牛的發(fā)情觀察和配種工作。因此，以孕酮為標(biāo)記蛋白進(jìn)行早期妊娠檢測(cè)時(shí)，需要對(duì)膠體金試紙條的檢測(cè)閾值進(jìn)行調(diào)整。且需要針對(duì)血清和尿液等不同檢測(cè)樣品來源，進(jìn)行閾值分類和細(xì)化，只有這樣才能保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

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Progesterone Concentration Change of Xiangxi Cattle in the Estrous Cycle and Earlier Gestation

LI Xiong1, LEI Hong1, LONG Yue2, LI Hao-bang1, LI Jian-bo1, LUO Xi3,LI Sheng1, YAN Hai-feng1, YI Kang-le1*

(1.Prataculture&HerbivoreLaboratory,HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience,Changsha,Hunan410131,China；2.HunanDenongAnimalHusbandryTechnologyCo.Ltd.,Huayuan,Hunan416400,China；ChangshaQianshanAnimalServiceCo.Ltd.,Changsha,Hunan410144,China)

Blood samples were collected from female Xiangxi cattle to detect and compare concentrations of progesterone during the estrous cycle and early pregnancy by ELISA. The results showed that during the estrous cycle in female Xiangxi cattle, the concentration of progesterone changed significantly with a trend from increase to decrease. In proestrus, estrus, metestrus and diestrus, the concentration of progesterone in blood samples were 8.85, 0.72, 1.40 and 9.13 ng/mL. The level of progesterone in estrus and metestrus were lower than that in proestrus and diestrus. During the early pregnancy of female Xiangxi cattle, the concentration of progesterone increased. In 0～10 d, 11～20 d, 21～30 d and 31～36 d after pregnancy, the concentration of progesterone were 3.36, 8.91, 12.69 and 16.12 ng/mL. The level of progesterone were significantly different in different stages. The progesterone of pregnant cows blood was significantly higher than non-pregnant cows 21 days, 24 days, 27 days, 30days in estrous (P<0.05). The progesterone in urine was significant higher than non-pregnant cows 20 days, 25 days, 30 days, 35 days in estrous (P<0.05). After 21 days in estrous, the progesterone in blood and urine had significant difference between pregnant cows and un-pregnant cows, being an indicator of pregnancy.

Xiangxi cattle;estrous cycle;earlier gestation;progesterone

2014-11-18

2015-03-09

湖南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2012NK2014)；湖南省科技計(jì)劃一般項(xiàng)目(2014NK4103)；長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(K1104131-21)

李 雄(1981-)，男，湖南岳陽(yáng)人，助理研究員，主要從事草業(yè)與畜牧科學(xué)。E-mail:10782328@qq.com

*[通訊作者] 易康樂(1980-)，男，湖南永州人，副研究員，碩士生導(dǎo)師,主要從事動(dòng)物繁殖生物技術(shù)。E-mail: yikangle@yeah.net

S811.6

A

1005-5228(2015)05-0055-04