王 悅，馬永明，濮曉萍

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

鼻息肉患者外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)及意義

王 悅，馬永明，濮曉萍

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

目的 檢測鼻息肉患者外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平，初步探討其與鼻息肉形成的關(guān)系。方法收集46例慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者的外周血作為鼻息肉組，另收22例單純鼻出血或者鼻中隔偏曲患者外周血作為對照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組患者的外周血中的Th17細(xì)胞的表達(dá)水平。結(jié)果鼻息肉組外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平為(4.03±0.69)%，明顯高于對照組的(1.35±0.26)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論鼻息肉的發(fā)生發(fā)展可能與高水平表達(dá)Th17細(xì)胞存在一定關(guān)系，具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鼻息肉；Th17細(xì)胞；發(fā)病機(jī)制

鼻息肉(Nasal polyps，NP)是一種各種原因?qū)е碌谋乔缓捅歉]黏膜慢性炎癥性疾病，成人發(fā)病率達(dá)1%～4.5%[1]。臨床以持續(xù)性鼻塞伴頭痛為主要就診原因，目前治療以類固醇激素噴鼻及鼻內(nèi)鏡手術(shù)為主，該病術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，發(fā)病機(jī)制不明確，近年來，各類炎性細(xì)胞及其釋放的炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子成為很多疾病研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)小組此前應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對鼻息肉局部組織中IL-17進(jìn)行了檢測[2]，發(fā)現(xiàn)局部鼻息肉組織中IL-17高水平浸潤，推測到鼻息肉患者外周血中以分泌IL-17為主的Th17細(xì)胞可能高水平表達(dá)。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測鼻息肉患者外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討它對鼻息肉發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有組織標(biāo)本來自2013年10月至2014年5月在本科住院患者。選取慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者46例(鼻息肉組)，其中男性28例，女性18例；以單純鼻出血或鼻中隔偏曲患者22例作為對照組，其中男性14例，女性8例。所有患者取外周靜脈血2 ml，收于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管，隨后3 h內(nèi)提取單個核細(xì)胞。所有患者術(shù)前1個月內(nèi)未使用皮質(zhì)類固醇激素(包括全身和局部)、非類固醇抗炎藥物、組胺藥物或者大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療。患者均無全身疾病、變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘或者阿司匹林過敏史。鼻息肉組患者術(shù)后病理回報均為鼻息肉；對照組患者均排除鼻-鼻竇炎病史，鼻竇CT檢查無鼻竇病變。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(FICOLL)選自天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心。單抗隆抗體(包括PE-抗人IL-17A，PE-Cyanine5-抗人CD3，F(xiàn)ITC-抗人CD8)及相應(yīng)同型抗體、Th17細(xì)胞破膜液及洗滌液均購于美國eBioscience公司。刺激霉素PMA，離子霉素(Ionomycin)，莫能霉素(Monensin)購自Enzo公司。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和RPMI-1640液選自維森特生物技術(shù)有限公司。0.01 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.2)自配后高壓處理。流式細(xì)胞儀FACS Canto及FACS Diva軟件為美國BD公司。

1.3 方法 第一步：提取單個核細(xì)胞：將外周血2 000 r/min，4℃，離心5 min，去上層血清。用等體積無菌PBS稀釋剩余血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞緩緩加到等體積的ficoll液面之上，2 000 r/min，24℃，離心15 min。取中間白膜層(單個核細(xì)胞層)，用1 ml無菌PBS洗滌2遍，500 g/min，4℃，離心5 min，去上清。用1 ml 10%胎牛血清1640稀釋單個核細(xì)胞。取其中10 μl，用PBS再稀釋5倍，顯微鏡下鮑氏計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)。第二步：流式細(xì)胞術(shù)：24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板每孔約2×106個單個核細(xì)胞，，每孔分別加入5 μl PMA(10 ng/μl)，1 μl離子霉素(1 μg/μl)，4 μl莫能霉素(0.5 μg/μl)，加10%胎牛血清1640使總體積為1 ml，置于37℃，5%CO2孵箱刺激5 h。然后收集細(xì)胞于無菌1.5 ml EP管，1 ml PBS洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。留100 μl PBS重懸，加PE-Cyanine5-抗人CD32 μl，F(xiàn)ITC-抗人CD84 μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育30 min。后離心去上清，1 ml PBS洗滌兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。每管加500 μl破膜液破膜，置混勻器上，4℃冰箱，避光30 min。離心去上清，1 ml洗滌液(原液用雙蒸水按1:9比例稀釋)洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。留40 μl洗滌液，加PE-抗人IL-17A 2 μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育1 h。1 ml洗滌液洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min，去上清。250 μl PBS重懸，50 μl多聚甲醛固定。所有標(biāo)本均做同型對照。用FACS Canto檢測Th17細(xì)胞的表達(dá)水平，并用FACS Diva軟件分析數(shù)據(jù)。由于既往研究證實(shí)PMA刺激會使T細(xì)胞胞膜CD4分子表達(dá)下降而影響檢測[3]，因此本實(shí)驗(yàn)以 CD3+CD8-IL-17A+代表CD3+CD4+IL-17A+，統(tǒng)計(jì)其在CD3+CD8-T細(xì)胞中的比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩獨(dú)立樣本之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

鼻息肉組與對照組患者外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平見圖1。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼻息肉組患者外周血中Th17細(xì)胞的比率較高，達(dá)4.73%，見圖1a，而對照組患者外周血中Th17細(xì)胞的比率較低，僅1.17%，見圖1b。鼻息肉組患者外周血Th17細(xì)胞的比率達(dá)(4.03±0.69)%，明顯高于對照組的(1.35±0.26)%，見圖1c。且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.25，P＜0.05)。

圖1 外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平

3 討論

本研究通過對鼻息肉患者外周血中Th17細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在鼻息肉患者外周血中表達(dá)較對照組患者顯著增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，據(jù)此推斷Th17細(xì)胞可能在鼻息肉的發(fā)病過程中起著重要作用，鼻息肉形成的具體過程自然與Th17細(xì)胞的功能密切相關(guān)。

Th17細(xì)胞是一種不同于Th1、Th2、Treg細(xì)胞的新型CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，是固有T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β和IL-23刺激下分化而來，其主要的效應(yīng)分子為IL-17，IL-17家族有A～F六個成員[4]，其中IL-17(即IL-17A)與IL-17F生物學(xué)功能相似，二者通過與各種細(xì)胞表面的IL-17RA和IL-17RC結(jié)合，啟動相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，促使各種炎性因子的分泌，從而使局部炎性組織中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、DC等聚集，產(chǎn)生抗病原微生物作用，促進(jìn)組織恢復(fù)正常[5]。在氣道炎癥性疾病中，IL-17能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6及GM-CSF，從而使中性粒細(xì)胞浸潤于病變部位，促使局部炎癥的持續(xù)[6]。

近年來，大量研究關(guān)注于Th17細(xì)胞或其分泌的主要效應(yīng)分子IL-17與各種疾病發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為Th17細(xì)胞在各種炎癥性疾病和自身免疫性疾病中都有較高水平表達(dá)，它的促炎作用是這些疾病發(fā)生的關(guān)鍵。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中，Th17細(xì)胞正是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子，使中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞聚集于滑膜，增強(qiáng)了局部炎癥反應(yīng)，使關(guān)節(jié)破壞加重[7-8]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清中IL-17顯著增高，并且在狼瘡性腎炎患者腎臟中檢測到高水平IL-17和IL-23，IL-17能夠促進(jìn)B細(xì)胞的生存，并協(xié)同B細(xì)胞激活因子避免B細(xì)胞的凋亡，從而增加產(chǎn)生自身抗體的細(xì)胞的數(shù)目，這可能在SLE發(fā)病中占有重要作用[9-10]。據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在炎癥性腸病[11]，克羅恩病[12]，多發(fā)性硬化[13]的發(fā)病中也都發(fā)揮著一定的作用。這使耳鼻咽喉科的研究者們也致力于探測Th17細(xì)胞的特異性細(xì)胞因子IL-17A在本學(xué)科疾病中的作用，試圖通過影響Th17細(xì)胞的分化增殖去促使一些疾病的好轉(zhuǎn)或減少疾病的復(fù)發(fā)。在2004及2005連續(xù)兩年的研究中，王鑫等[14-15]發(fā)現(xiàn)在鼻息肉組織中IL-17及其受體表達(dá)增多，認(rèn)為IL-17是導(dǎo)致鼻息肉發(fā)生的重要細(xì)胞因子。這為我們研究Th17細(xì)胞與鼻息肉提供了一定的基礎(chǔ)，由于Th17細(xì)胞分泌的炎性因子較多，我們實(shí)驗(yàn)組通過流式細(xì)胞術(shù)直接對這種炎性細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果表明慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者外周血中Th17細(xì)胞較對照組有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為Th17細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子通過外周循環(huán)到達(dá)鼻腔黏膜，與相應(yīng)受體結(jié)合，誘發(fā)中性粒細(xì)胞和單個核細(xì)胞聚集，長期炎癥刺激導(dǎo)致鼻黏膜破壞、重塑，最終形成嚴(yán)重的息肉病變。

本研究僅簡單地對鼻息肉患者外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)率進(jìn)行了檢測，而關(guān)于其在鼻息肉形成過程中的具體作用環(huán)節(jié)還尚未明確，對此進(jìn)一步的研究將為我們治療鼻息肉及防止其復(fù)發(fā)具有重要的臨床意義。

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Expression and significance of Th17 cells in patients with nasal polyps.

WANG Yue,MA Yong-ming,PU Xiao-ping.
Department of Otolaryngology,the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212002, Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of Th17 cells in peripheral blood in nasal polyps,and to explore the role of Th17 cells in pathogenesis of nasal polyposis.MethodsThe peripheral blood samples were collected from 46 patients of chronic sinusitis with nasal polyp(CRSwNP,the study group)and 22 patients with simple nasal bleeding or nasal septum deviation(the control group).Flow cytometry was used to detect the expression levels of Th17 cells in peripheral blood in the two groups.ResultsThe levels of Th17 cells in the study group was(4.03%±0.69%),significantly higher than(1.35%±0.26%)in the control group(P＜0.05).ConclusionThe pathogenesis of CRSwNP may be involved in the increased expression of Th17 cells,and the detailed mechanisms should be further studied.

Nasal polyps;Th17 cells;Pathogenesis

R765.25

A

1003—6350（2015）15—2231—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0805

2014-12-23)

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項(xiàng)目資助(編號：SH2013053)

馬永明。E-mail：maym121@163.com