高宇勤，郝霽萍，趙國平

(1.西安市第九醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054；2.暨南大學醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合系，廣東 廣州 510632)

·論 著·

芍藥苷預處理激活AMPKα對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

高宇勤1，郝霽萍1，趙國平2

(1.西安市第九醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054；2.暨南大學醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合系，廣東 廣州 510632)

目的 探究芍藥苷預處理激活AMPKα信號通路對大鼠在體心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法本實驗共用SPF級雄性SD大鼠30只，分三組，分別為假手術(shù)組、缺血再灌注組、藥物預處理組，采用結(jié)扎SD大鼠心臟LAD的方法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，利用0.5%Evan's藍灌注心肌，1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸緩沖液孵育心肌，CK-MB試劑盒來觀察心肌缺血、壞死及肌酸磷酸激酶(CK-MB)和HE染色觀察心肌損傷程度，利用蛋白印跡(Western blot)技術(shù)探究芍藥苷預處理對腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα)的影響。結(jié)果芍藥苷藥物預處理組與缺血再灌注組比較，藥物預處理組心梗面積較缺血再灌注組明顯減小(P＜0.01)；CK-MB檢測也發(fā)現(xiàn)藥物預處理組與缺血再灌注組比較能明顯降低CK-MB值(P＜0.01)；HE染色發(fā)現(xiàn)藥物預處理組較缺血再灌注組能明顯減輕大鼠心肌局灶性腫脹、心肌間質(zhì)水腫，減少炎性細胞浸潤及血管充血；蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)藥物預處理組能明顯促進AMPKα蛋白的表達，升高磷酸化AMPKα的表達。結(jié)論芍藥苷預處理能減輕大鼠在體心肌缺血再灌注損傷，可能通過增加AMPKα蛋白的表達，促進AMPKα磷酸化而實現(xiàn)。

芍藥苷；心肌缺血再灌注損傷；腺苷酸活化蛋白激酶

缺血預處理能明顯減輕心肌缺血再灌注損傷的程度，是一種有效的內(nèi)源性保護機制[1]。但是缺血預處理在臨床實踐中因為倫理和操作的不現(xiàn)實難以執(zhí)行。因此探索用藥物來代替缺血預處理，即藥物模擬缺血預處理就成為研究的熱點，目前有大量研究也證實許多模擬性藥物預處理及后處理確實具有類似缺血預處理的保護作用[2-4]。芍藥苷(Paeoniflorin)是單萜糖苷類化合物，是毛茛科植物芍藥干燥根中的一種生物活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對腦缺血損傷具有保護作用[5-6]，但是對于心肌缺血再灌注損傷研究較少，特別是在體研究方面尤為缺乏。本實驗采用在體大鼠冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)模型來觀察芍藥苷預處理對心肌保護作用及其與腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 芍藥苷購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(批號ZL20090409SYG)，抗pAMPKα (Thr172，兔抗鼠一抗)和AMPKα抗體購于美國細胞信號(Cell Signaling)生物技術(shù)公司；其余皆為國產(chǎn)試劑。

1.2 建立動物模型 SPF級雄性SD大鼠30只，體重280～400 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0002。大鼠稱重后注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，麻醉后固定大鼠仰臥于手術(shù)臺，剪除頸部和胸部被毛，碘伏消毒，縱形剪開頸部皮膚長1.5～2.0 cm，分離皮下組織及肌肉，顯露氣管及甲狀腺，于甲狀腺后方鈍性分離氣管并帶線，提起絲線，剪刀于氣管環(huán)之間剪開氣管半周，氣管插管，接呼吸機，調(diào)整呼吸頻率60次/min、通氣量20 ml/kg。于胸骨左緣3 mm處縱形剪開胸部皮膚長約4 cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌與前鋸肌，撐開胸大肌及前鋸肌，顯露肋骨及肋間肌，于第三肋間隙逐步剪開肋間肌，顯露胸膜，于呼氣時大鑷子刺破胸膜，進入胸腔，撐開肋骨，撕破心包，顯露心臟，探查確定左心耳，確定縫扎位置(肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm，前降支LAD近端位置)，用0#線，疊一個0.8～1.0 mm的凹槽硅膠管，出針打結(jié)結(jié)扎LAD，缺血30 min，松開結(jié)扎，復灌2 h。模型復制的可靠性用ECGⅡ?qū)?lián)的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功(見圖1)。本實驗建模時共計有3只SD大鼠因為麻醉和手術(shù)原因死亡，死亡率為10%。

1.3 分組及給藥方案 芍藥苷與生理鹽水混合，于灌胃前加熱溶解混均，藥物預處理組大鼠給予芍藥苷100 mg/kg灌胃，一天灌胃一次，連續(xù)灌胃4 d，最后一次于手術(shù)前30 min給予。30只雄性SD大鼠(體重280～400 g)被隨機分為三組，每組10只，每組中5只進行心梗面積及缺血面積測定，另外5只進行其他指標測定，三組分別為假手術(shù)組(此組只開胸，但不結(jié)扎LAD)、缺血再灌注組和藥物預處理組。

1.4 心肌梗死面積測定 實驗終點時暴露心臟，原位結(jié)扎左冠狀動脈主干，經(jīng)主動脈逆行灌注(壓力為80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)0.5%Evan's藍2～3 ml，立即取出心臟，以預冷生理鹽水沖洗殘余血液，將左室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，隨即取出冷凍心臟，沿左室長軸方向連續(xù)環(huán)切，每片2～3 mm。正常心肌組織為藍色，缺血區(qū)心肌組織為粉色，分離無藍染缺血區(qū)和藍染非缺血區(qū)，濾紙吸干，分別稱重，缺血面積為無藍染缺血區(qū)重量與無藍染缺血區(qū)和藍染非缺血區(qū)重量之和之比。然后將無藍染缺血心肌置入1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸緩沖液(pH 7.4)中，在37℃下孵育20 min，此時壞死區(qū)(NZ)呈灰白色，非壞死區(qū)(NNZ)呈深紅色，然后將NZ和NNZ分離，濾紙吸干，置于電子天平上稱重。梗死面積由壞死心肌重量與缺血心肌重量(壞死區(qū)與非壞死區(qū)之和)之比表示。

1.5 心肌組織HE染色 再灌注結(jié)束后迅速剪下心臟，置于冰緩沖液中洗凈，分離左心室前壁缺血區(qū)，切取3～5 mm3組織，置于10%中性甲醛固定12 h，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、染色及中性樹膠封片，鏡下觀察心肌病理形態(tài)。

1.6 蛋白印跡(Western blot)檢測 配制10%分離膠，5%濃縮膠，上液蛋白總量120 μg，進行電泳。轉(zhuǎn)膜條件：AMPKα蛋白檢測用350 mA恒流濕轉(zhuǎn)45 min；一抗孵育條件：anti-pAMPKα(1:500)、anti-AMPKα (1:1 000)、Anti-GAPDH(1:2 000)，4℃孵育過夜，二抗(1:5 000)。將Western blot ECL發(fā)光液A、B各500 μl等量混合后涂在PVDF膜上，覆蓋膠片，于暗房中曝光，掃描儀掃描Western blot圖像，Quantity one軟件分析Western blot條帶的灰度值。

1.7 肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)檢測 按照試劑盒檢測說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功的心電圖表現(xiàn)

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷預處理對心肌梗死面積及CK-MB的影響 本實驗利用0.5%Evan's藍灌注心肌、1%TTC磷酸緩沖液孵育心肌、CK-MB試劑盒分別觀察心肌缺血、壞死面積及CK-MB的變化。結(jié)果表明，藥物預處理組與缺血再灌注組比較，前者較后者心梗面積明顯減小，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；利用CK-MB檢測發(fā)現(xiàn)藥物預處理組較缺血再灌注組能明顯降低CK-MB值，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 芍藥苷預處理對心肌梗死面積及CK-MB的影響(±s)

表1 芍藥苷預處理對心肌梗死面積及CK-MB的影響(±s)

注：藥物預處理組與缺血再灌注組比較，aP＜0.01。

假手術(shù)組缺血再灌注組藥物預處理組886.53±54.46 4367.37±879.52 1912.74±249.14a555 0.58±0.02 0.61±0.03 0.59±0.02 0.00±0.00 0.37±0.07 0.14±0.05a

2.2 芍藥苷預處理對心肌組織病理形態(tài)的影響 本實驗利用HE染色觀察芍藥苷預處理對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌病理形態(tài)的影響(見圖2)。假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊、染色均勻、結(jié)構(gòu)清晰，心肌無萎縮、肥大或壞死，也無炎細胞浸潤等病理形態(tài)改變，心肌細胞染色清晰、形態(tài)完整、橫紋清晰、細胞核致密，未見細胞水樣變性等病理改變；缺血再灌注組大鼠心肌損傷明顯，心肌纖維排列紊亂，不均勻嗜伊紅染色增強，心肌間質(zhì)水腫，組織間隙明顯增寬，血管擴張、充血、出血等，心肌細胞多處腫脹、溶解斷裂，橫紋不清或消失，心肌細胞發(fā)生空泡樣變性等，細胞核腫脹甚至銷蝕、脫失；而藥物預處理組的心肌損傷較缺血再灌注組的心肌損傷程度輕，在藥物預處理組中心肌纖維結(jié)構(gòu)尚完整，可見局灶性輕度腫脹，嗜伊紅染色增強，心肌間質(zhì)輕度水腫，組織間隙輕度增寬，可見少量炎細胞浸潤，血管略充血，心肌細胞排列尚整齊，部分核染色呈深染改變。從組織病理學提示芍藥苷預處理可以減輕缺血再灌注損傷程度。

圖2 芍藥苷預處理心肌組織病理的影響(×200)

2.3 芍藥苷預處理對大鼠心肌AMPKα的影響 本實驗采用蛋白印跡(Western blot)技術(shù)觀察芍藥苷預處理對大鼠心肌AMPKα信號通路的影響。實驗結(jié)果顯示：藥物預處理組能促進AMPKα蛋白的表達，與缺血再灌注組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；藥物預處理組能升高磷酸化pAMPKα的表達，與缺血再灌注組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。上述結(jié)果說明芍藥苷預處理能明顯增加AMPKα蛋白的表達，而且能促進AMPKα磷酸化，見圖3。

圖3 芍藥苷預處理對大鼠心肌AMPKα的影響

3 討論

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種重要的酶促能量平衡和調(diào)控的信號通路[7]，擔任細胞內(nèi)能量感應器的作用。AMPK是一個由α、β、γ 3個亞基構(gòu)成的異三聚體蛋白，α亞基起催化作用，α亞單位中的數(shù)個位點(蘇氨酸172、蘇氨酸258、絲氨酸485等)均可被磷酸化，其中蘇氨酸172位點被磷酸化在AMPK活性的調(diào)節(jié)中起重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路與心肌缺血再灌注損傷(MIRI)有密切的關(guān)系，當AMPK活化后，首先可以抑制心肌細胞凋亡，保護心臟功能。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK活性被長期抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠其心臟功能正常，無心肌肥大或心肌纖維化，但在低流量缺血和缺血再灌注后，與野生型鼠比較，轉(zhuǎn)基因鼠心功能恢復受損，心肌損傷程度加重，Caspase2、3活性增加，心肌細胞凋亡增加[8]。也有研究[9]發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以減少MIRI心肌細胞凋亡，其抗凋亡作用就是通過AMPK的活化來實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK活化后具有抗炎作用。AMPK的活化抑制了缺血后白細胞和內(nèi)皮細胞之間的粘附，減少炎癥細胞的局部聚集，從而發(fā)揮抗炎作用。由于AMPK活化后具有抗凋亡、抗炎等作用[9]，因此通過干預AMPK信號通路來發(fā)揮心肌保護作用是目前研究的一個熱點，也是一個創(chuàng)新點。

芍藥苷是單萜糖苷類化合物，是毛茛科植物芍藥干燥根中的一種生物活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對腦缺血損傷具有保護作用[5-6]，但是對于心肌缺血再灌注損傷研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷預處理可以清除氧自由基從而保護心肌細胞膜和細胞器膜免受氧化應激損傷，同時能減輕細胞內(nèi)鈣超載，保護心肌細胞免受再灌注損傷[10]；芍藥苷[11]還可降低BAX及Caspase-3的表達，上調(diào)BCL-2的表達，減少心肌細胞凋亡及心肌梗死面積，干預MIRI，但是對于AMPK信號通路的影響未見相關(guān)研究，而且上述研究結(jié)論都是通過離體實驗獲得的。

本實驗采用了結(jié)扎SD大鼠心臟LDA的方法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，此模型能更真實體現(xiàn)藥物的藥理學作用。實驗中發(fā)現(xiàn)藥物預處理組能明顯減少心梗面積(與缺血再灌注組比較，P＜0.01)；肌酸磷酸激酶(CK-MB)檢測亦證實芍藥苷預處理能減輕心肌損傷程度(與缺血再灌注組比較，P＜0.01)。從組織學形態(tài)觀察亦發(fā)現(xiàn)芍藥苷藥物預處理能明顯減輕大鼠心肌局灶性腫脹、心肌間質(zhì)輕度水腫，減少炎性細胞浸潤、血管充血。本實驗利用蛋白印跡(Western blot)技術(shù)觀察芍藥苷預處理對大鼠心肌AMPKα信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)藥物預處理組能促進AMPKα蛋白的表達，能促進磷酸化pAMPKα的表達，結(jié)果說明芍藥苷預處理減輕缺血再灌注損傷是部分通過增加AMPKα蛋白的表達，促進AMPKα磷酸化而實現(xiàn)。

[1]Montero MF,Saurim R,Bonservizi WG,et al.Heart injury following intestinal ischemia reperfusion in rats is attenuated by association of ischemic preconditioning and adenosine[J].Acta Cir Bras, 2014,29(Suppl 2):67-71.

[2]Efthymiou CA,Mocanu MM,Yellon DM.Atorvastatin and myocardial reperfusion injury:new pleiotropic effect implicating multiple prosurvival signaling[J].J Cardiovasc Pharmacol,2005,45(3): 247-252.

[3]Bell RM,Clark JE,Hearse DJ,et al.Reperfusion kinase phosphorylation isessential but not suff i cient in the mediation of pharmacological preconditioning:characterisation in the biphasic prof i le of early and late protection[J].Cardiovasc Res,2007,73:153-163.

[4]Liu LF,Qin Q,Qian ZH,et al.Protective effects of melatonin on ischemia-reperfusion induced myocardial damage and hemodynamic recovery in rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(23): 3681-3686.

[5]Li XF,Wen ZB,He XF,et al.Effects of Cinnamic acid on expression of Tissue factor induced by TNFα in endothelial cells and its mechanisms[J].J Chin MedAssoc,2006,69(5):207-212.

[6]王君萍,韋穎梅,郭 梅,等.芍藥苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡相關(guān)基因的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6 (3):310-312.

[7]Bouma HR,Ketelaar ME,Yard BA,et al.AMP-activated protein kinase as a target for preconditioning in transplantation medicine[J]. Transplantation,2010,21(6):560-568.

[8]Hao J,Kim HS,Choi W,et al.Mechanical stretch-induced protection againstmyocardialischemia-reperfusion injury involves AMP-activated protein kinase[J].Korean J Physiol Pharmacol, 2010,14(1):1-9.

[9]汪 俊,邵名亮,曹 蘅,等.脂聯(lián)素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J],中華心血管病雜志,2010,38(3):752-758.

[10]劉旭春,韋穎梅.芍藥苷預處理對大鼠離體缺血再灌注損傷心臟的保護作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2009,7(10): 1177-1179.

[11]Nizamutdinova IT,Jin YC,Kim JS,et al.Paeonol and paeoniflorin, the main active principles of Paeonia albiflora,protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury inrats[J].Planta Med, 2008,74(1):576-584.

Protective effects of pretreatment with paeoniflorin on the myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo by activating AMPK α.

GAO Yu-qin1,HAO Ji-ping1,ZHAO Guo-ping2.
1.Department of Cardiovascular Medicine,the Ninth Affiliated Hospital of Xi'an,Xi'an 710054,Shaanxi,CHINA;2.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,College of Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effects of pretreatment with paeoniflorin on the myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo by activating AMPKα.MethodsThe SPF grade male SD rats(30 rats) were divided into three groups:sham operation group[the rats'chests were opened,but the left anterior descending coronary arteries(LAD)were not ligated],ischemia reperfusion group and paeoniflorin pretreatment group,each with 10 cases.Myocardial ischemia reperfusion injury model was established by cardiac LAD ligation in SD rats.The degree of myocardial injury was observed by HE staining and perfusion of 0.5%Evan's blue and 1%triphenyl tetrazolium chloride(TTC).Western blot was used to explore the effects of paeoniflorin pretreatment on AMPKα.ResultsIn comparison with ischemic reperfusion group,paeoniflorin pretreatment could decrease infarction area significantly(P＜0.01)and reduce the value of creatine phosphokinase(CK-MB)significantly(P＜0.01).HE staining showed paeoniflorin pretreatment could significantly relieve myocardial focal swelling,intermyocardial swelling,inflammatory cell infiltration,and vascular engorgement.Western blot showed that paeoniflorin pretreatment could increase the expression of AMPKα and promote the phosphorylation of AMPKα.ConclusionPretreatment with paeoniflorin could relieve myocardial ischemia reperfusion injury of rats in vivo.The effect is probably achieved by increasing the expression of AMPKα and promoting phosphorylation ofAMPK α.

Paeoniflorin;Myocardium ischemia reperfusion injury;AMP-activated protein kinase alpha (AMPK α)

R-332

A

1003—6350（2015）15—2185—05

2015-03-23)

國家自然科學基金（編號：81173189）；西安市衛(wèi)生局科技項目及西安市科技項目（編號：SF1416）

郝霽萍。E-mail：gaoyuqin1234567@aliyun.com