劉炯炯 胡紅琳 夏 莉 王長江 方朝暉

西格列汀對肥胖大鼠代謝指標(biāo)及脂肪因子chemerin 脂聯(lián)素水平的影響

劉炯炯 胡紅琳 夏 莉 王長江 方朝暉

目的 研究西格列汀對肥胖大鼠代謝指標(biāo)及脂肪因子chemerin、脂聯(lián)素(ADPN)水平的影響及其可能機(jī)制，并探討chemerin及ADPN與肥胖的關(guān)系。方法 將30只大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組)、肥胖對照組(HF組)和肥胖西格列汀干預(yù)組(SP組)，ELISA法分別測定干預(yù)前后各組大鼠生化指標(biāo)，Western blot 法檢測大鼠脂肪、肝臟、肌肉及腎臟組織chemerin及ADPN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與NC組相比，HF組大鼠血清chemerin、體質(zhì)量(BW)，空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)、總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，胰島素抵抗指數(shù)(HOMO-IR)增高，血清ADPN及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低(P<0.05)，HF組大鼠脂肪、肝臟、肌肉及腎臟組織的chemerin蛋白表達(dá)量較NC組對應(yīng)組織的表達(dá)量增加(P<0.05)，脂肪、肝臟及肌肉組織的ADPN表達(dá)量減少(P<0.05)。與HF組相比，SP組大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL-C、HOMO-IR、血清chemerin水平降低， HDL-C及血清ADPN水平升高(P<0.05)，脂肪、肝臟、腎臟及肌肉組織的chemerin蛋白表達(dá)量減少，脂肪、肌肉組織的ADPN表達(dá)增加(P<0.05)。干預(yù)前chemerin、ADPN與BW、FBG、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、HOMO-IR有相關(guān)性，干預(yù)后chemerin、ADPN與BW、LDL-C、FINS、HOMO-IR有相關(guān)性，ADPN與HDL-C呈正相關(guān)。結(jié)論 chemerin及ADPN參與糖脂代謝過程，西格列汀可改善血清學(xué)各代謝指標(biāo)，并通過影響chemerin及ADPN來改善肥胖大鼠胰島素敏感性。

肥胖；西格列??；chemerin；脂聯(lián)素

肥胖是一種低度的慢性炎癥過程，過度分化的脂肪細(xì)胞可產(chǎn)生大量的脂肪因子，如chemerin、脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)及瘦素等，不僅可以在脂肪組織內(nèi)部發(fā)揮作用，而且可以影響食物攝取、體質(zhì)量、胰島素敏感性、炎癥、凝血和血管功能等[1]，而西格列汀作為一種新型降糖藥物對脂肪因子chemerin及ADPN的影響目前鮮有報(bào)道。本研究通過建立高脂肥胖大鼠模型來明確西格列汀是否通過對chemerin及ADPN水平的影響而影響糖脂代謝，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Roche Modular全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)，穩(wěn)豪血糖儀(美國強(qiáng)生公司)，胰島素放免試劑盒(北京原子高科公司)，ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)，羥甲基淀粉酶(上海蒙究實(shí)業(yè)有限公司)，chemerin及ADPN小鼠抗大鼠單克隆抗體(英國Abcam公司)，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗及兔抗小鼠二抗(英國Abcam公司)，ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑(美國millipore公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 普通級SD大鼠30只，雄性6周齡，(160.0±30.5)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)條件為室溫(22±2)℃，濕度55%左右，自然晝夜節(jié)律，自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組：正常對照組(NC組，n=10)和高脂飼料組(n=20)。NC組予以普通飼料(由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心配制)喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；高脂組給予高脂飼料喂養(yǎng)。12周后，取高脂組中體質(zhì)量高于NC組體質(zhì)量均數(shù)20%的大鼠為肥胖模型造模成功(n=16)。

1.3 干預(yù)方式 16只高脂大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為兩組，兩組均繼續(xù)予以高脂飼料喂養(yǎng)。肥胖西格列汀干預(yù)組(SP組，n=8)：灌胃給予磷酸西格列汀10 mg/(kg·d)，溶于2 mL羥甲基淀粉酶中，每日灌胃時(shí)間于早9點(diǎn)，持續(xù)6周。肥胖對照組(HF組，n=8)：灌胃給予2 mL生理鹽水作為空白對照。

1.4 血標(biāo)本收集與處理 高脂喂養(yǎng)12周后，所有大鼠禁食12 h，內(nèi)眥靜脈取血2 mL，第18周末，大鼠末次干預(yù)后，禁食12 h，稱重，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血3 mL，血標(biāo)本靜止15 min后，3 000 r/min離心10 min，留取血清置于-80℃冰箱保存。

1.5 指標(biāo)測定 通過測定體質(zhì)量(body weight,BW)，空腹血糖(fasting glucose,FBG)、胰島素(fasting insulin,FINS)、總膽固醇(total cholesterol,TG)、甘油三酯(triglyceride,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)，胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,HOMO-IR)[HOMO-IR=FINS(mIU/L)×FBG(mmol/L)/22.5]，血清chemerin與ADPN來明確西格列汀干預(yù)前后對血清各指標(biāo)的影響。

1.6 western blot法檢測組織中chemerin 及ADPN蛋白表達(dá) 提取脂肪中的總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量。依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，chemerin小鼠抗大鼠單克隆抗體(1 ∶1 000) 4 ℃ 孵育過夜后，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1 ∶4 000) 室溫下孵育2 h。ADPN小鼠抗大鼠單克隆抗體(1 ∶1 000) 4 ℃ 孵育過夜后，辣根酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗(1 ∶2 000) 室溫下孵育2 h。充分洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影并進(jìn)行膠片顯影定影處理。采用上述相同方法，在相同條件下完成肝臟組織、肌肉及腎臟組織chemerin、ADPN及各對應(yīng)的β-actin 蛋白檢測。圖像掃描并分析各條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前生化指標(biāo)與血清chemerin、ADPN比較 與NC組相比，HF組大鼠的血清chemerin、BW、FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR升高，ADPN及HDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HF組與SP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 干預(yù)后生化指標(biāo)與血清chemerin、ADPN比較 與HF組比較，SP組各血清chemerin、FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR顯著降低，HDL-C及血清ADPN水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SP組與HF組BW差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組織中chemerin與ADPN蛋白表達(dá) HF組與SP組大鼠脂肪、肝臟、肌肉及腎臟組織的chemerin蛋白表達(dá)量較NC組對應(yīng)組織的表達(dá)量增加(P<0.05)；SP組大鼠脂肪、肝臟、腎臟、肌肉組織的chemerin蛋白表達(dá)量較HF組對應(yīng)組織的表達(dá)量減少(P<0.05)。HF組及SP組脂肪、肝臟及肌肉組織的ADPN表達(dá)量較NC組對應(yīng)組織表達(dá)量減少，SP組大鼠脂肪、肌肉組織ADPN表達(dá)較HF組增加，見圖1、表3。

表1 西格列汀干預(yù)前生化指標(biāo)與血清chemerin、ADPN比較

注：與NC組比較，*P<0.05

表2 西格列汀干預(yù)后生化指標(biāo)與血清chemerin、ADPN比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與HF組比較，#P<0.05

圖1 脂肪、肝臟、肌肉、腎臟組織chemerin及ADPN蛋白表達(dá)水平比較(A：脂肪組織；B：肝臟組織；C：肌肉組織；D；腎臟組織；1：NC組；2：HF組；3：SP組)

表3 西格列汀對各組織中chemerin蛋白表達(dá)的影響

注：與NC組比較：#P<0.05；與HF組比較：*P<0.05

2.4 血清chemerin、ADPN與生化指標(biāo)相關(guān)性分析 干預(yù)前chemerin與BW、FBG、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、HOMO-IR呈正相關(guān)，與ADPN呈負(fù)相關(guān)；干預(yù)后與BW、LDL-C、FINS、HOMO-IR呈正相關(guān)，與血清ADPN呈負(fù)相關(guān)。干預(yù)前ADPN與BW、FBG、TC、HLDL-C、FINS、HOMO-IR、血清chemerin呈負(fù)相關(guān)；干預(yù)后與HDL-C呈正相關(guān)，與BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMO-IR、血清chemerin呈負(fù)相關(guān)。見表4。

表4 西格列汀干預(yù)前后chemerin與各生化指標(biāo)相關(guān)性

3 討論

1995年Sherer等[2]首次報(bào)道了一種由脂肪組織分泌的血漿激素蛋白-ADPN，其分子量約為30 000， 可通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作，其受體廣泛分布在腦、心、腎、肝、骨骼肌、胰腺等多種組織中。胡紅琳等[3]利用糖尿病人群分析胰島素抵抗程度與脂肪因子的研究中，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與胰島素抵抗有關(guān)。而Chemerin最初是在1997年使用差異顯示法被識別的，作為維A酸反應(yīng)基因出現(xiàn)在銀屑病皮膚損傷中，人類Chemerin編碼基因全長3 289 bp，位于染色體7q36.1，在白色脂肪組織、肝臟和胎盤中高表達(dá)[4]，兩者均與肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究證實(shí)肥胖大鼠體內(nèi)ADPN水平降低，chemerin水平升高，同時(shí)血脂、血糖代謝紊亂，胰島素抵抗程度增加，這與Stejskal[5]、Jortay等[6]的研究結(jié)果相一致。相關(guān)性分析結(jié)果提示chemerin、ADPN均與BW、FBG、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、HOMO-IR有相關(guān)性，且ADPN與血清chemerin呈負(fù)相關(guān)，說明ADPN及chemerin可能均參與了糖脂代謝過程、胰島素抵抗的發(fā)生，而且兩種脂肪因子間相互影響。根據(jù)本研究western blot分析，肥胖大鼠脂肪、肝臟、肌肉及腎臟組織的chemerin蛋白表達(dá)量較非肥胖大鼠增加，而ADPN表達(dá)量在肥胖大鼠脂肪、肝臟及肌肉組織的較非肥胖大鼠減少，說明在這種糖脂代謝紊亂的內(nèi)環(huán)境下可刺激于脂肪、肝臟、腎臟及肌肉組織中chemerin的基因表達(dá)，而脂肪、肝臟及肌肉組織中ADPN的基因表達(dá)受抑制，具體是影響了蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯還是翻譯后修飾過程有待于進(jìn)一步研究。

西格列汀作為DPP-4抑制劑，可以選擇性的抑制DPP-4的生物活性，延遲GLP-1的降解，發(fā)揮降低血糖、促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、促進(jìn)β細(xì)胞再生等作用[7]。

除上述作用外，本研究顯示西格列汀干預(yù)6周后還可改善肥胖大鼠高血脂狀態(tài)、炎癥狀態(tài)及胰島素抵抗程度，并且不增加大鼠的體質(zhì)量。相關(guān)性分析得出西格列汀干預(yù)后BW、LDL-C、FINS、HOMO-IR同時(shí)與chemerin及ADPN有相關(guān)性，ADPN與HDL-C呈正相關(guān)，說明西格列汀主要通過改善高胰島素血癥、胰島素敏感性及高血脂狀態(tài)來影響機(jī)體的炎癥狀態(tài)。另外干預(yù)后ADPN仍然與chemerin呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中發(fā)現(xiàn)雖然西格列汀干預(yù)后總體趨勢是chemerin降低，ADPN增高，但一些大鼠在干預(yù)6周后僅chemerin降低或僅ADPN增加，還有些大鼠是既有chemerin的降低也有ADPN的升高，最終發(fā)現(xiàn)chemerin與ADPN均有變化的大鼠胰島素抵抗改善程度要大于前者，但由于樣本量少，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但仍可以說明西格列汀在調(diào)節(jié)炎癥因子過程中是多向調(diào)節(jié)的，不僅使單一的因子產(chǎn)生變化，也可使炎癥因子間相互作用。

通過western blot分析得出西格列汀可增加大鼠脂肪與肌肉細(xì)胞的ADPN表達(dá)量，說明西格列汀對ADPN的調(diào)節(jié)是通過脂肪與肌肉組織共同作用的，其有可能通過增強(qiáng)ADPN對肌肉中AMPK及PPARα通路的影響來增加肌肉組織對葡萄糖攝取和脂肪氧化，并且促進(jìn)脂質(zhì)向脂肪細(xì)胞聚積，減少異位脂肪沉積，從而增加機(jī)體胰島素敏感性[8]。western blot分析還得出在肝臟、脂肪、肌肉及腎臟中chemerin的表達(dá)量均有所下降，提示這些組織均是西格列汀的作用靶點(diǎn)，已有研究證實(shí)在骨骼肌組織中chemerin是抑制葡萄糖攝取的[9]，而在脂肪組織中chemerin對葡萄糖攝取的作用存在分歧，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)上述chemerin的升高與胰島素抵抗程度的增加存在相關(guān)性說明chemerin對脂肪組織葡萄糖攝取是起抑制作用的，西格列汀可能解除這種抑制作用來增加胰島素敏感性。有研究顯示Tomoyuki等[10]發(fā)現(xiàn)IR可促進(jìn)脂質(zhì)的降解使游離脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，異位沉積的肝臟脂肪導(dǎo)致氧化應(yīng)激，故推測西格列汀可通過改善肝臟、脂肪、肌肉及腎臟組織中高胰島素狀態(tài)及胰島素敏感性影響機(jī)體脂肪因子的表達(dá)，進(jìn)而影響血清中chemerin及ADPN的濃度。

綜上所述，脂肪因子chemerin及ADPN在肥胖大鼠胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，西格列汀作為新型抗糖尿病藥物可影響大鼠糖脂代謝及脂肪因子的水平，是否有其他機(jī)制參與有待于進(jìn)一步研究。

[1] Romacho T,Elsen M,Eckel J,et al.Adipose tissue and its role in organ crosstalk[J].Acta Physiol(Oxf),2014,210(4):733-753.

[2] Yamauchi T,Nio Y,Maki T,et al.Targeted disruption of AdipoR1 and AdipoR2 causes abrogation of adiponectin binding and metabolic actions[J].Nat Med,2007,13(3):332-339.

[3] 胡紅琳,王長江,王佑民,等.血清脂聯(lián)素、抵抗素與2型糖尿病[J].安徽醫(yī)學(xué),2006,27(5):349-351.

[4] Roh S,Song SH,Choi KC,et al.Chemerin-A new adipokine that modulates adipogenesis via its own receptor[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,362(4):1013-18.

[5] Stejskal D,Karpisek M,Hanulova Z,et al.Chemerin is an independent marker of the metabolic syndrome in a Caucasian population-a pilot study[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub,2008,152(2):217-221.

[6] Jortay J,Senou M,Abou-Samra M,et al.Adiponectin and skeletal muscle:pathophysiological implications in metabolic stress[J].Am J Pathol,2012,181(1):245-256.

[7] Gallwitz B.Review of sitagliptin phosphate a novel treatment for type 2 diabetes[J].Vasc Health Risk Manag,2007,3(2):203-210.

[8] Yamauchi T,Kamom J,Ito Y,et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects[J].Nature,2003,423(6941):762-769.

[9] Sell H,Laurencikiene J,Taube A,et al.Chernerin is a novel adipocyte-derived factor inducing insulin resistance inprimary human skeletal muscle cells[J].Diabetes,2009,58(12):2731-2740.

[10]Tomoyuki I,Masato Y,Masahiko I.Sitagliptin as an novel treatment agent fornon-alcoholi Fatty liver disease patients with type 2 diabetesm ellitus[J].Hepato-gastroenterology,2011,58(112):2103-2105.

(2015-03-24 收稿 2015-05-29 修回)

Influence of sitagliptin on metabolic parameters and adipocytokines levels of obesity rats

LiuJiongjiong,HuHonglin,XiaLi,etal

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China

Objective To investigate the effects of sitagliptin on metabolic parameters, chemerin and adiponectin levels of obesity rats, and to explore the relationship between the chemerin and adiponectin with obesity. Methods A total of 30 rats were randomly divided into normal diet group (NC), high-fat control group (HF) and sitagliptin intervention group (SP). The rats′ metabolic parameters were measured by ELISA.The chemerin and adiponectin protein expression levels in kidney adipose, liver and muscle tissue were detected by western blot. Results Compared with NC group, the serum chemerin, BW, FBG, FINS, TC, TG, LDL-C, HOMO-IR levels of high-fat model group were increased, HDL-C and adiponectin were decreased. Chemerin expression levels of high-fat control group in adipose, liver and kidney tissues increased compared with NC group, the expression of adiponectin in adipose, liver and muscle tissues was decreased. Compared with HF group, sitagliptin could down-regulate the levels of FBG, FINS, TC, TG, LDL, HOMO-IR, serum chemerin. The HDL-C and adiponectin were up-regulated. After sitagliptin treatment, chemerin expression levels in adipose, liver, kidney and muscle were reduced, and the expression of adiponectin in adipose and muscle tissue was increased. Correlation analysis showed that before intervention, chemerin and adiponectin were correlated with FBG, TG, HDL, LDL-C, FINS, HOMO-IR and BW. After intervention, chemerin and adiponectin had correlation with BW, LDL-C, FINS, HOMO-IR at the same time, adiponectin has positive correlation with HDL-C. Conclusion Chemerin and adiponectin may be a key participate element in the development of obesity. Sitagliptin can improve the metabolic indexes remarkably in serum, and improve insulin sensitivity in obesity rats by influencing the levels of chemerin and adiponectin.

Obesity;Sitagliptin;Chemerin;Adiponectin

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230022 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(劉炯炯，胡紅琳，夏莉，王長江) 230022 合肥 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(方朝暉)

夏莉, xiali0205@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.09.002