鄧卓峰，周 崢

牙周牙髓聯(lián)合病變是牙周病或根尖周病晚期發(fā)生的導(dǎo)致廣泛牙周組織破壞及牙髓病變綜合征［1-4］，其與口腔中的微生物共同作用是導(dǎo)致失牙的重要原因［5］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR-DGGE等檢測微生物菌群方法的應(yīng)用促進(jìn)了口腔生物學(xué)的進(jìn)步，牙周牙髓聯(lián)合病變依據(jù)病變來源分為牙周源性、牙髓源性和二者聯(lián)合作用導(dǎo)致的牙髓病變［6］。本文著重分析牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變的微生物感染種類，為臨床針對性治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1—12月收治的牙周牙髓聯(lián)合病變38例，其中男21例，女17例;年齡23～38(25.26±2.92)歲。所有患者進(jìn)行了病史、臨床口腔?？茩z查和影像學(xué)檢查。38例選取78顆患牙，患牙均因存在炎癥致Ⅱ～Ⅲ度松動，其牙周袋深度≥5 mm［7］，且至少存在1個牙位牙周袋探診深度至根尖，且均無齲、無隱裂等牙體疾病，3個月內(nèi)未使用過抗生素。同時選取同期38例來我院進(jìn)行正畸的78顆同樣牙位的拔除牙作為對照樣本，男20例，女18例;年齡22～40(26.12±2.88)歲。患者無其他口腔疾病，均知情同意，排除齲齒、非齲性疾病、隱裂，3個月內(nèi)使用過抗生素者。兩組年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 標(biāo)本采樣方法

1.2.1 牙周袋標(biāo)本:兩組均采集牙周袋標(biāo)本，在操作前以無菌刮匙清除齦上菌斑，防止齦上菌斑干擾，之后以生理鹽水漱口1 min，取樣牙采用棉卷隔離隔濕，探診患牙牙周袋至根尖的牙根牙周組織，隔濕吹干，以吸潮紙紙尖蘸取牙周袋牙冠2/3的齦溝液，之后迅速放入牙周袋底部，約20～30 s后取出，以無菌剪刀剪下其尖端5 mm放入含有PBS液的離心管;同時以無菌刮治器探入牙周袋底部刮取牙根的菌斑于滅菌的PBS液中。2種操作均重復(fù)1次，均于-20℃保存作為牙周袋標(biāo)本。

1.2.2 根管采樣:在患牙拔出后，在根尖1/3處截斷，如無成形牙髓時，采用蘸有無菌生理鹽水的無菌銼反復(fù)銼根尖1/3處的根管后壁，之后將無菌吸潮紙插入，停留20～30 s取出，以無菌剪刀剪下其尖端5 mm作為根管標(biāo)本。

1.3 標(biāo)本檢測方法 將存于-20℃的樣本解凍，8000 r/min離心3 min，去上清后加入90μl緩沖液(主要為溶菌酶)37℃處理30 min，采用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取2種標(biāo)本DNA，并以其為模板，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌通用引物［8］，上游引物為968f-GC(5＇-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3＇)，下游為 1401r(5＇-CGGTGTGTACAAGACCC-3 ＇)，生 成 全 長 為 16S r DNA的V2-V3區(qū)［8-9］。模板DNA加熱至93℃ 4 min后，使其雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成雙鏈DNA解離成單鏈，以為其與引物結(jié)合進(jìn)行下輪反應(yīng)循環(huán);之后，溫度降至55℃，引物與模板DNA單鏈互補序列配對結(jié)合，形成DNA模板-引物結(jié)合物，其在 Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸過程，在其過程中根據(jù)不同的PCR引物序列，設(shè)置不同的退火溫度和時長［10］(第一步:93℃變性 4 min、55℃退火 40 s、70℃延伸 1.5 min;第二步:93℃1 min、56℃30 s、72℃30 s;72℃優(yōu)化7 min)。PCR反應(yīng)體系為50μl(北京全式金生物科技公司)，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。每個樣本取35μl，變性劑凝膠的濃度采用40% ～60%的6%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行100%變性，之后采用1∶10 000的 SYBR GreenⅠ核酸燃料染色40 min，將染色的凝膠采用ImageLab成像系統(tǒng)分析拍照，觀察標(biāo)本的電泳條帶，并將有代表性的條帶進(jìn)行切膠至滅菌的蒸餾水中(4℃ 24 h)后，離心取上清為模板進(jìn)行PCR循環(huán)，之后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序并使用GenBank的BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析和序列同源性比較［8，11］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗;相關(guān)因素分析采用Spearman相關(guān)性分析，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 微生物檢出情況 觀察組48顆患牙標(biāo)本檢出微生物，檢出率為61.54%。48顆患牙牙周袋均檢出微生物，檢出率為100%;29顆患牙根管牙髓檢出微生物，檢出率為60.42%。牙周袋微生物檢出率高于根管(χ2=9.128，P＜0.05)。對照組12顆檢出微生物，檢出率為15.38%，均為牙周袋檢出。觀察組患牙微生物檢出率高于對照組(χ2=14.927，P ＜0.05)。

2.2 菌屬情況 觀察組BLAST測序結(jié)果顯示，患牙標(biāo)本中牙周袋菌屬為變形菌門的彎曲菌屬34顆、放線菌屬42顆、梭桿菌門的梭桿菌屬28顆、腸桿菌門的腸桿菌屬19顆和變形菌門的嗜血桿菌屬14顆;根管標(biāo)本菌屬為放線菌門的棒狀桿菌屬25顆和放線菌屬4顆。對照組拔除牙齒中牙周袋菌屬為奈瑟菌屬8顆、放線菌屬6顆和彎曲菌屬3顆。兩組同一標(biāo)本具有多重微生物感染。

2.3 菌種條帶 對觀察組牙周袋、根管牙髓標(biāo)本和對照組標(biāo)本菌種條帶做PCA發(fā)現(xiàn)，觀察組中牙周袋標(biāo)本菌種條帶14.33%～57.85%在同顆牙根管牙髓標(biāo)本中存在，但根管牙髓標(biāo)本中菌種條帶有1.32%～67.55%在同顆牙牙周袋標(biāo)本中不存在。觀察組中菌種條帶1.21%～4.38%在對照組同位牙標(biāo)本中存在，但對照組標(biāo)本中菌種條帶有0～0.57%在觀察組同位牙標(biāo)本中不存在。

2.4 菌種與牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變相關(guān)性分析 將觀察組和對照組的棒狀桿菌屬、放線菌屬、彎曲菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬進(jìn)行賦值(陽性=1，陰性 =0)，以牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變(陽性=1，陰性=0)為應(yīng)變量Y，以上因素為自變量X進(jìn)行回歸分析顯示，牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變與彎曲菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬、腸桿菌屬、嗜血桿菌屬感染呈正相關(guān)(r=0.232，P＜0.05)。

3 討論

牙髓和牙周組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)互通，因此當(dāng)發(fā)生牙周牙髓聯(lián)合病變時，二者微生物感染種類常交叉感染，致難區(qū)分牙周牙髓聯(lián)合病變的來源是牙周源性還是牙髓源性，或者是二者聯(lián)合作用。國內(nèi)外文獻(xiàn)對可能引起牙周牙髓聯(lián)合病變微生物種類的系統(tǒng)研究較少，而著重單獨研究牙周源性導(dǎo)致的牙周牙髓聯(lián)合病變的報道更少［6-10］。為了增加此方面的臨床觀察數(shù)據(jù)，本研究采用了PCR-DGGE生物技術(shù)檢測了牙周牙髓聯(lián)合病變患牙中牙周袋和根管內(nèi)微生物情況，初步探討了牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變的微生物種類。

傳統(tǒng)研究中將口腔微生物測定以細(xì)菌培養(yǎng)法為主，其認(rèn)為限定了菌種的范圍［11-12］，難以全面分析口腔微生物菌種情況，因此本文采用了PCR-DGGE法，其通過分析細(xì)菌菌落的基因多態(tài)性可直觀識別菌種而不受培養(yǎng)條件限制，其敏感度和特異度相對均較高［13］，因此可全面分析微生物的種類。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙周牙髓聯(lián)合病變的牙周袋微生物檢出率為100%，高于根管牙髓微生物檢出率的60.42%，對照組牙周袋微生物檢出率為100%，說明牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變與微生物感染相關(guān)。對其感染的菌種條帶分析發(fā)現(xiàn)，觀察組中牙周袋標(biāo)本菌種條帶14.33%～57.85%在同顆牙根管的牙髓標(biāo)本中存在，但根管牙髓標(biāo)本中菌種條帶有1.32% ～67.55%在同顆牙牙周袋標(biāo)本中不存在;觀察組中菌種條帶1.21%～4.38%在對照組同位牙標(biāo)本中存在，但對照組標(biāo)本中菌種條帶有0～0.57%在觀察組同位牙標(biāo)本中不存在，說明牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙牙周組織和牙髓組織中的菌群結(jié)構(gòu)和組成具有相似性的同時還具有差異性，這可能與患牙局部內(nèi)環(huán)境差異和其中原有微生物的存在相關(guān)，即局部微環(huán)境自然選擇的結(jié)果［14］。另外，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，牙周組織的菌群在牙周炎進(jìn)展到一定程度時可通過根管、根尖等通道進(jìn)入到牙髓中存活、繁殖，導(dǎo)致牙髓損傷，或影響到根管內(nèi)牙髓的微環(huán)境，從而使牙髓內(nèi)原有微生物復(fù)蘇［15-21］。

根據(jù)BLAST測序檢測微生物種類發(fā)現(xiàn)牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變牙周袋微生物感染以彎曲菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬、腸桿菌屬、嗜血桿菌屬為主;牙髓主要以棒狀桿菌屬和放線菌屬感染為主;而正常人群口腔檢出菌屬以奈瑟菌屬、放線菌屬和彎曲菌屬為主，這與 Krmek 等［22］、Chaniotis等［23］、萬蕾和章錦才［24］的研究結(jié)果相似。對菌種與牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變相關(guān)性分析結(jié)果顯示，牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變與彎曲菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬、腸桿菌屬、嗜血桿菌屬感染有關(guān)。

總之，牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變發(fā)生與微生物感染有關(guān)，且牙周源性與牙髓源性感染微生物種類既有相似又有不同，因此臨床可針對其微生物感染種類進(jìn)行輔助治療［25-28］，以提高治愈率。

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