馬濤 李世昌

1 齊魯師范學院（濟南250200）

2 華東師范大學

骨組織的正常生長及更新有賴于骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡[1]。由破骨細胞作用的骨吸收是骨重建的起點，它可以清除損傷或沒有承載功能的骨組織，繼而啟動由成骨細胞作用的骨形成過程， 使骨組織始終處在不斷動態(tài)更新的過程中[2]。 我們前期的研究[3]已經研究了下坡跑運動對去卵巢小鼠成骨細胞分化和骨形成的影響， 發(fā)現(xiàn)下坡跑運動能夠促進去卵巢小鼠成骨細胞的分化和骨形成作用。然而，運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化的影響及分子機制還少見報道。

在某些狀態(tài)下， 破骨細胞數(shù)量異常及功能紊亂會發(fā)生骨量過分減少的疾病， 如骨吸收功能亢進的骨質疏松癥等[4]。婦女絕經后骨質疏松癥就是由于絕經后雌激素迅速下降引起破骨細胞大量生成及活化造成的[5]?？咕剖崴嵝粤姿崦福╰artrate-resistant acid phosphatase，TRAP）屬于溶酶體酶，具有5a和5b兩個亞型，后者由破骨細胞特異性釋放[6]，因此，骨組織中TRAP的分泌及表達量可以間接反映破骨細胞生成及活化情況。 在破骨細胞的分化和活化過程中，OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)起著至關重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)破骨細胞內與OPGRANKL-RANK相關的信號轉導通路主要有NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Ca2+/CN/ NFAT信號通路、PI3K/Akt信號通路和蛋白激酶C信號通路等。 其中，NF-κB信號通路是破骨細胞分化和活化最重要的一條通路[7，8]。

已有研究表明[2]，適度運動可有效降低婦女絕經后的骨質流失， 從而有效防止婦女絕經后骨質疏松癥的發(fā)生。 運動時骨代謝調節(jié)激素的變化以及骨組織所受的機械應力均可能對骨代謝產生影響。 本研究探討運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化的影響， 以及NF-κB信號通路在介導運動對破骨細胞分化影響過程中的作用， 并進一步深入研究運動影響骨組織的細胞及分子機制； 本研究還探索上坡跑和下坡跑兩種不同方式的運動對骨組織影響的差異， 進一步豐富防治骨質疏松的運動方式。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：Citrate Solution （Sigma）、Acid Phosphatase、Leukocyte （TRAP） Kit（Sigma）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天）、胰蛋白酶（碧云天）、紅細胞裂解液（碧云天）、溴酚藍（上海生工）、TEMED（明睿生物）、Glycine（明睿生物）、β-actin一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、各目的蛋白一抗（兔抗鼠，Santa Cruz）、Odyssey熒光二抗（山羊抗兔，Odessey）。

主要儀器：包埋機（Leica）、切片機（Leica）、撈片機（Leica）、烤片機（Leica）、Leica DM4000電子顯微鏡（Leica）、圖象分析軟件Image-Pro Plus 5.0、UV1102分光光度計（上海天美）、Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（eBioscience）。

1.2 動物分組及訓練方案

32只小鼠在本實驗中心動物房適應性喂養(yǎng)1周，然后隨機分為4組，即假手術安靜組（S組，n = 8）、去卵巢安靜組（O組，n=8）、去卵巢上坡跑組（U組，n = 8）、去卵巢下坡跑組（D組，n=8）。動物以1%戊巴比妥鈉（0.1 g/kg）經腹腔麻醉后， 剪除長毛， 分別在脊柱兩側切開背肌1 cm切口，假手術安靜組小鼠行去卵巢假手術，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織，其余3組小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊腸線縫合傷口，在傷口外涂少量紅霉素軟膏。

假手術安靜組和去卵巢安靜組在籠中正常飼養(yǎng)，不進行任何訓練， 去卵巢上坡跑組和去卵巢下坡跑組于去卵巢手術后7天開始訓練，訓練方案與本實驗室前期小鼠上、下坡跑臺訓練方案一致[9，10]（表1）：

1.3 取材

于運動組小鼠最后一次訓練結束24 h后，摘眼球取血處死小鼠。 取其左側股骨，投于4%多聚甲醛溶液中固定，待做石蠟切片，進行骨組織TRAP染色。 取其兩側肱骨、脛骨和右側股骨，放入PBS中，以備對骨髓細胞進行破骨細胞分化誘導培養(yǎng)，待測破骨細胞分化過程中NFκB信號通路p65、p-p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表達。

1.4 測試方法

1.4.1 股骨抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及計量

脫鈣及包埋：將小鼠左側股骨在4%PFA溶液中4℃冰箱過夜，第2天4%PFA換液1次。 24小時后，將組織投入10%EDTA溶液脫鈣1周。1周后10%EDTA換液1次，繼續(xù)脫鈣1周。雙蒸水清洗后將組織投入PBS，室溫靜置2～3小時。 梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。

TRAP染色：5 μm厚度切片，展片，撈片，烤片，二甲苯脫臘，梯度酒精水化，雙蒸水清洗。 配制TRAP染色固定液和染液，加入固定液，室溫固定30 s。雙蒸水清洗后加入染液，37℃水浴中染色4小時。 用雙蒸水清洗，封片保存。

表1 運動組小鼠訓練方案

拍片及計量：Leica DM4000電子顯微鏡拍照，用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件統(tǒng)計股骨骨骺部位TRAP陽性染色區(qū)域的平均光密度值 （average optical density，AOD） 和平均陽性染色面積百分比（average positive staining area percentage，APSAP）。

1.4.2 破骨細胞原代培養(yǎng)及NF-κB信號通路蛋白檢測

破骨細胞原代培養(yǎng)及NF-κB信號通路蛋白的制備： 骨髓造血干細胞的搜集方法同本實驗室的前期研究文獻相同[11]，之后將干細胞接種于6孔板，密度為每孔6×105個細胞，加入10 ng/ml的M-CSF培養(yǎng)2天，干細胞逐漸分化為破骨細胞前體， 然后加入10 ng/ml 的RANKL 刺激15分鐘，搜集細胞蛋白。經0.05%胰蛋白酶消化后用預冷的PBS漂洗3次，加入450 μl裂解液，細胞刮棒刮出細胞裂解物， 在超聲細胞破碎儀中以最大強度超聲4次，每次15～30 s，在每次超聲步驟之間將樣品轉置水浴中15 s，加入Laemmli 樣品緩沖液混勻。100 ℃水浴3分鐘，10000 g離心10分鐘，取出上清液，將其移入另一潔凈試管中，將所得的蛋白質樣品于-20 ℃存放待測。

Western blot 測定破骨細胞前體NF-κB信號蛋白表達： BCA法測定蛋白總濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，麗春紅染色，晾干后根據(jù)蛋白質maker標志和目的蛋白的分子量剪膜。 5%的脫脂牛奶封閉后進行抗體孵育，一抗和熒光二抗?jié)舛染鶠?∶2000。 Odyssey熒光掃描及測試，將膜放在odyssey熒光凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，并用odyssey凝膠圖像處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，以待測蛋白與內參蛋白的平均密度之比作為待測蛋白的相對表達水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

各檢測結果以均數(shù)±標準差表示，用SPSS12.0 軟件進行方差分析，以P ＜0.05為差異顯著性標準，以P ＜0.01 為差異非常顯著性標準。

2 結果

2.1 股骨骨骺TRAP 染色計量

成熟的破骨細胞分泌破骨細胞特異性酶——抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），經TRAP染色后破骨細胞細胞質呈紅色陽性染色。從圖1和圖2可以看出，呈紅色陽性染色的破骨細胞多分布于骨骺、 骺板以及干骺端的骨吸收陷窩內，沿骨吸收陷窩邊緣排列，以骺板部位的破骨細胞最為密集， 另外在皮質骨的外表面也分布有大量紅色陽性染色的破骨細胞。

由表2可知， 去卵巢安靜組股骨TRAP陽性染色區(qū)域的AOD和APSAP均較假手術安靜組顯著升高（P＜0.01）；與去卵巢安靜組相比，兩運動組股骨TRAP陽性染色區(qū)域的AOD和APSAP均顯著降低（P ＜0.01，P ＜0.05）； 兩運動組之間相比較， 去卵巢下坡跑組股骨TRAP陽性染色區(qū)域的AOD和APSAP均較去卵巢上坡跑組顯著降低（P ＜0.01）。

圖1 股骨TRAP染色整體圖

表2 股骨骨骺TRAP染色計量

2.2 破骨細胞前體IκBα和p-IκBα蛋白表達

如圖3所示：各組小鼠破骨細胞前體IκBα蛋白相對表達量無顯著性差異， 而p-IκBα蛋白相對表達量組間差異顯著。 去卵巢安靜組p-IκBα蛋白相對表達量顯著高于假手術安靜組（P ＜0.01）；兩運動組p-IκBα蛋白相對表達量顯著低于去卵巢安靜組（P ＜0.01）；而兩運動組相比較， 去卵巢下坡跑組p-IκBα蛋白相對表達量顯著低于去卵巢上坡跑組（P ＜0.01）。

圖2 股骨骨骺TRAP 染色圖250×

2.3 破骨細胞前體p65和p-p65蛋白表達

如圖4所示： 各組小鼠破骨細胞前體p65蛋白相對表達量無顯著性差異，而p-p65蛋白相對表達量組間差異顯著。去卵巢安靜組p-p65蛋白相對表達量顯著高于假手術安靜組（P ＜0.01）；兩運動組p-p65蛋白相對表達量顯著低于去卵巢安靜組（P ＜0.01）；而兩運動組相比較，去卵巢下坡跑組p-p65蛋白相對表達量顯著低于去卵巢上坡跑組（P ＜0.05）。

3 討論

3.1 上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠骨組織TRAP的影響

骨重建是一個復雜的過程， 其主要與破骨細胞及成骨細胞的代謝過程有關， 涉及到破骨細胞作用的骨吸收和緊隨其后的成骨細胞作用的骨形成[5]。婦女絕經后骨質疏松癥就是由于絕經后雌激素迅速下降引起破骨細胞大量生成及活化導致的[12]。TRAP屬于溶酶體酶，它包括多種同工酶，主要存在于骨、前列腺、血小板、紅細胞和脾臟等。 TRAP各種同工酶具有不同的屬性，如骨的同工酶具有抵抗L（+）-酒石酸鹽抑制的作用，而前列腺的同工酶可被有機酸所抑制。 TRAP屬于酸性磷酸酶的第5類同工酶[13]。 TRAP具有5a和5b兩個亞型，后者由破骨細胞特異性釋放[6]。破骨細胞在骨吸收過程中特異性釋放TRAP，因此，骨組織中TRAP的分泌及表達量可以間接反映破骨細胞生成及活化情況，TRAP是一個有價值的骨吸收標志物[14]。 血清中的TRAP檢測比較簡便，既可以用動態(tài)方法測定其活性（根據(jù)對酒石酸鹽抵抗的程度）， 也可以應用TRAP的抗體直接進行免疫測定。 但是，血液循環(huán)中的TRAP也來源于其它非骨組織細胞，如巨噬細胞等[15]。 雖然有部分資料已表明，血清中的TRAP可用于評估骨吸收狀態(tài)， 但目前對TRAP是否可在骨質疏松中作為評價骨吸收的標志物仍未見大量研究。 其主要原因為血清TRAP并不具有很強的骨組織特異性，以及標本冰凍后不穩(wěn)定；此外，血中的多種酶抑制劑影響了TRAP的敏感性[16]。 本研究采用骨組織TRAP染色方法直接檢測局部骨組織TRAP的表達及分布，彌補了血清TRAP檢測方法對骨組織特異性不高的缺點， 能夠較準確地反映骨組織中破骨細胞特異性標志酶TRAP的表達量，從而間接反映局部骨組織破骨細胞的生成及活化情況。

圖3 各組小鼠破骨細胞前體IκBα和p-IκBα蛋白表達

圖4 各組小鼠破骨細胞前體p65和p-p65蛋白表達

本研究結果顯示： 小鼠去卵巢后骨組織破骨細胞特異性酶TRAP大量生成，顯示去卵巢手術可引起小鼠骨組織破骨細胞的大量分化和活化， 從而使骨吸收作用大大增強，增加骨質疏松風險。而跑臺運動可以顯著降低骨組織破骨細胞特異性酶TRAP生成，這說明跑臺運動有效地抑制了去卵巢后小鼠骨組織中破骨細胞的大量生成及活化，從而有效阻止了骨吸收。該結果和本實驗室的前期研究結果相吻合， 本實驗室的前期研究結果[9]顯示，跑臺運動能夠顯著阻止小鼠去卵巢后骨密度和骨結構出現(xiàn)的退行性變化， 從而有效防止骨質疏松的發(fā)生，且體現(xiàn)出運動方式的差異性，即下坡跑效果優(yōu)于上坡跑。

3.2 上、下坡跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化NFκB通路的影響

在破骨細胞的分化和活化過程中，OPG-RANKLRANK系統(tǒng)起著至關重要的作用[17]。RANKL和破骨細胞前體細胞膜上的RANK結合后， 通過連接蛋白TRAFs（TRAF2、TRAF5、TRAF6，其中主要是TRAF6），激活下游多種信號分子， 引起一系列信號轉導反應和細胞生物學效應[18]。 目前發(fā)現(xiàn)破骨細胞內與RANK相關的信號轉導通路主要有：NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Ca2+/CN/NFAT信號通路、PI3K/Akt信號通路和蛋白激酶C信號通路等[19]。 其中，NF-κB信號通路是破骨細胞分化和活化最重要的一條通路， 研究表明NF-κB1和NFκB2雙突變鼠缺少TRAP陽性破骨細胞[7，8]。 NF-κB屬于NFκB/Rel家族，是一種重要的轉錄因子，RANKL的信號經RANK 傳 遞 給TRAF6，TRAF6 通 過NIK （NF-κB inducible kinase）和IKK（the IκB kinase）活化NF-κB。哺乳動物表達兩類共5個Rel（NF-κB）蛋白[20]。 第1類蛋白包括RelA（P65）、C- Rel和RelB，這類蛋白作為成熟的產物合成， 不需要進一步蛋白酶解。 第2類蛋白包括NF-κB1 和NF-κB2，這類蛋白首先合成大的前體p105和p100，然后經過蛋白水解，最終分別成為成熟的p50和p52 NF-κB蛋白。 在細胞靜息狀態(tài)時，RelA或c-Rel和NF-κB組成的二聚體通過與IκB抑制蛋白結合而被保留在細胞質中， 最常見的形式為p50-p65-IκBα或p50-p65-IκBβ[21]。 在信號通路激活時，IκBα被IκB激酶（IKK）磷酸化，進而被泛素降解，從而使NF-κB二聚體與κBα脫離，脫離了κBα的NF-κB二聚體被激活，迅速進入細胞核并與相應靶基因的啟動子結合， 通過啟動和調控基因的轉錄來調節(jié)破骨細胞的分化、 功能和凋亡[22，23]。

在本研究中，與假手術安靜組相比，去卵巢安靜組小鼠破骨細胞前體p-p65和p-IκBα蛋白表達顯著增加，而p65和IκBα蛋白表達則未見顯著性變化。這說明小鼠去卵巢后，由于雌激素迅速減少，通過RANKL途徑和其他途徑激活了NIK和IKK， 使IκBα磷酸化程度提高，從而激活了破骨細胞分化的NF-κB信號通路， 促進破骨細胞分化，造成高轉換型骨質疏松。但去卵巢安靜組小鼠破骨細胞前體p65和IκBα蛋白表達并未比假手術安靜組增加， 說明雌激素的迅速下降雖不能使NF-κB信號通路的p65和IκBα蛋白表達增加，但可以通過NIK和IKK使上述蛋白發(fā)生磷酸化而激活NF-κB信號通路。與去卵巢安靜組相比， 兩跑臺運動組小鼠破骨細胞前體p-p65和p-IκBα蛋白表達顯著下降，而p65和IκBα蛋白表達變化無顯著性差異。 這說明，跑臺運動可以通過抑制破骨細胞分化的NF-κB信號通路而影響骨代謝，使破骨細胞的生成得到有效抑制，從而減緩骨吸收速度。兩跑臺運動組之間相比較， 去卵巢下坡跑組對破骨細胞前體p-p65和p-IκBα蛋白表達的抑制效果更明顯，且兩組具有顯著性差異。 這說明這兩種應力方式不同的跑臺運動，對骨代謝造成的影響也不同，下坡跑運動比上坡跑運動對抑制破骨細胞分化的NF-κB信號通路更有效。

3.3 上、 下坡跑臺運動對去卵巢小鼠破骨細胞分化影響結果的差異性分析

在本研究中，對上、下坡跑臺運動兩種運動方式對去卵巢小鼠破骨細胞分化的影響進行了對比研究，盡管結果顯示兩種運動方式均能對去卵巢小鼠破骨細胞的過度分化起到有效的抑制作用，然而對比之下，下坡跑運動效果顯著優(yōu)于上坡跑運動。 產生這種運動方式效果差異的原因， 我們認為主要是在兩種運動方式過程中，小鼠骨組織，特別是下肢骨組織所受的力學刺激不同。在運動過程中，骨組織除受到骨骼肌收縮對其產生的牽拉、擠壓和剪切等力學刺激外，來自于地面的反作用力對其的機械應力則是最主要應力因素， 而下坡跑運動過程中小鼠下肢骨所受到的來自跑臺的反作用力明顯大于上坡跑過程中小鼠下肢骨受到的應力，在本實驗室前期發(fā)表的論文中已有對此結果的相關討論[9]。

4 總結

小鼠去卵巢后骨組織破骨細胞特異性酶TRAP大量生成， 顯示去卵巢手術可引起小鼠骨組織破骨細胞大量分化和活化，從而使骨吸收作用大大增強，增加骨質疏松風險。

跑臺運動可通過抑制破骨細胞分化過程中p65和IκBα蛋白的磷酸化而有效抑制破骨細胞分化的NF-κB信號通路，從而有效抑制骨吸收作用，且下坡跑效果優(yōu)于上坡跑。

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