唐光旭 張寒夢(mèng) 袁獻(xiàn)雙 石麗君

1 河西學(xué)院體育學(xué)院（甘肅張掖734000）

2 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理教研室

血管平滑肌的收縮狀態(tài)決定血管腔的大小， 血管平滑肌緊張度異常增大參與了血管疾病的發(fā)生機(jī)制。更好地理解調(diào)節(jié)血管緊張度的分子機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療血管疾病至關(guān)重要。 高血壓最重要的發(fā)病機(jī)制即血管阻力增加，但是其分子機(jī)制還未完全闡明。 Ras同源基因家族成員A （Ras homolog gene family member A，RhoA） 是小G蛋白超家族中Rho家族的Rho亞族中的一個(gè)成員， 它含有所有小GTP結(jié)合蛋白中高度保守的GDP／GTP結(jié)合區(qū)和GTP酶活性區(qū)， 此外還具有靶區(qū)和膜定位結(jié)構(gòu)[1]。 靜息狀態(tài)時(shí)，RhoA與GDP結(jié)合存在于胞質(zhì)中，RhoA被激活后向具有活性的RhoA-GTP轉(zhuǎn)變，同時(shí)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜。 當(dāng)恢復(fù)靜息狀態(tài)時(shí)，RhoA從胞膜轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)。被激活的RhoA-GTP在下游激活其靶目標(biāo)Rho激酶（ROCK），后者與蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphase，MLCP）的MYPT1亞基結(jié)合，使其T850和T696位點(diǎn)發(fā)生磷酸化而失活， 導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)平滑肌的收縮[2]。 RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可以通過(guò)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的各種作用介導(dǎo)血管緊張度的改變，調(diào)節(jié)血管阻力，甚至參與高血壓的發(fā)生和發(fā)展[3]。

Rho激酶參與高血壓的發(fā)生與發(fā)展首次被Uehata等[4]間接提出，他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到Rho激酶特異性抑制劑Y-27632可顯著降低高血壓模型大鼠血壓。 另外，于自發(fā)性高血壓大鼠 （Spontaneously hypertensive rat，SHR） 孤束核使用Rho激酶抑制劑或顯性失活Rho突變體，可導(dǎo)致其心率和血壓持續(xù)下降，而在正常血壓大鼠卻未見(jiàn)明顯變化，也提示Rho激酶參與了高血壓外周及交感神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)制[5-7]。其它系列研究表明，法舒地爾（fasudil，Rho激酶抑制劑）可顯著抑制冠狀血管病變并通過(guò)減少內(nèi)皮超氧陰離子的產(chǎn)生而改善內(nèi)皮舒張功能，從而抑制高血壓模型中的心臟肥厚，也提示Rho激酶很大程度上參與了高血壓性血管疾病和高血壓性心臟肥厚的發(fā)生[8，9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK通路與其它多種參與調(diào)節(jié)血管功能的信號(hào)通路都存在相互作用，如eNOS、AngⅡ、NADPH氧化酶、細(xì)胞外基質(zhì)等。 研究證實(shí)NO可負(fù)性調(diào)節(jié)RhoA/ROCK通路[10]，而AngⅡ可正性調(diào)節(jié)此通路[11]。 運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體中多種內(nèi)源性物質(zhì)均有調(diào)節(jié)作用，如運(yùn)動(dòng)可下調(diào)動(dòng)脈AngⅡ含量以及增加其NO含量， 從而降低血壓， 提示運(yùn)動(dòng)與高血壓的RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可能存在聯(lián)系。 然而查閱文獻(xiàn)，有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓動(dòng)脈收縮特性以及血管平滑肌細(xì)胞中RhoA蛋白表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。 本研究以RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的Rho和Rho激酶為著眼點(diǎn)， 應(yīng)用離體微血管環(huán)張力測(cè)定以及Pull down技術(shù)，通過(guò)8周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練， 初步探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓動(dòng)脈功能改善中的RhoA/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制， 為闡明高血壓發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)療法的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 對(duì)該通路的深入研究，不僅對(duì)高血壓病，同時(shí)也可為其他多種疾病的防治提供新策略。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和分組

原發(fā)性高血壓模型選用12周齡、 健康雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）12只，隨機(jī)分為高血壓安靜對(duì)照組（SHR-SED，n = 6）和高血壓有氧運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX，n =6）。 同時(shí)選用同齡雄性WKY（Wistar-Kyoto）大鼠6只作為正常血壓對(duì)照組（WKY），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 動(dòng)物生產(chǎn)許可證批號(hào)SCXK（京）2012-0001，動(dòng)物使用許可證批號(hào)SYXK（京）2011-0034，動(dòng)物批號(hào)（11400700028798），于北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。高血壓有氧運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX）大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)方案是適應(yīng)性訓(xùn)練1周（10 m/min，15 min/day）后，進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度0°，20 m/min（約55%～65%VO2max），5d/wk，60 min/day[12，13]。 高血壓安靜對(duì)照組（SHR-SED）和正常血壓對(duì)照組（WKY）不運(yùn)動(dòng)，自由進(jìn)食飲水。

1.2 無(wú)創(chuàng)血壓和心率測(cè)定

各組大鼠分別于訓(xùn)練前（第12周）及訓(xùn)練后（第21周）進(jìn)行尾動(dòng)脈血壓及心率監(jiān)測(cè)，儀器采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-2010A（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）。

1.3 大鼠腸系膜動(dòng)脈收縮特性檢測(cè)

在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后的24～48h內(nèi)， 將大鼠腹腔麻醉（戊巴比妥，50 mg/kg）后斷頭處死，迅速打開(kāi)腹腔取腸系膜動(dòng)脈（2 min內(nèi)完成），用于下述兩部分實(shí)驗(yàn)，一部分用于血管環(huán)收縮張力檢測(cè)， 另一部分立即投入液氮中暫存，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于RhoA-GTP蛋白表達(dá)檢測(cè)。 用于血管環(huán)收縮張力檢測(cè)的組織先放入4℃Na-Hepes緩沖液中， 在體視顯微鏡下剝離腸系膜上的脂肪組織，剪取約1.5 mm長(zhǎng)的二級(jí)動(dòng)脈環(huán)。 血管環(huán)用兩根1.5 cm左右的鎢絲固定在DMT浴槽中，一端固定在微調(diào)標(biāo)尺上，以調(diào)節(jié)微血管靜息張力，另一端與張力換能器相連浸入pH值為7.4、37℃的Na-Hepes緩沖液中，并向浴液內(nèi)通以95%O2－5%CO2，平衡10 min，使血管基礎(chǔ)張力維持在1 mN左右。 以120 mM的KCl刺激血管收縮，沖洗血管3次，待張力穩(wěn)定后加入40 mM的LNAME，孵育10 min。 為檢測(cè)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在各組之間的功能差異，我們先給予血管環(huán)NE（10-5M）誘發(fā)血管收縮， 在達(dá)到平臺(tái)后， 以濃度遞增方式加入Rho激酶抑制劑Y-27632（3×10-8－10-5M），觀察血管環(huán)反應(yīng)特性。

1.4 大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA-GTP蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.4.1 組織蛋白抽提

從-80℃冰箱中取出腸系膜動(dòng)脈組織，放入研缽中液氮研磨粉碎。 稱取約100 mg組織粉末，放入1.5 ml的離心管中，迅速加入500 μl RIPA裂解液，用勻漿器在冰水浴中勻漿10次左右。將勻漿液于4℃以13，400×g 離心30 min，取上清液，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白的終濃度為0.5 mg/ml。

1.4.2 蛋白質(zhì)純化及Pull down

取30 μg蛋白樣品進(jìn)行RhoA總蛋白表達(dá)的檢測(cè)；各取250 μg蛋白分別作為陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照樣品制備。 陽(yáng)性對(duì)照：取250 μg蛋白加入1/100體積的GTPγS，室溫混勻孵育15 min后，加入stop buffer（1/10體積），并放置于4℃終止反應(yīng)。 陰性對(duì)照中除加入1/100體積的GDP外，其余操作同陽(yáng)性對(duì)照的制備。 向250 μg待測(cè)蛋白樣品、陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣品中分別加入25 μl rhotekin-RBD beads，4℃搖床混勻孵育1 h。 4℃4000×g離心1 min，棄上清。預(yù)冷wash buffer 洗滌beads 1次。加入15 μl 2×laemmli sample buffer，沸水煮2min。 4000×g離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE。 上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，使用1∶500一抗以及1∶10000山羊抗鼠二抗孵育，曝光顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均以Mean ± SEM表示， 應(yīng)用SPSS19.0、GraphPad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 采用單因素方差分析（ANOVA）以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P ＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR基礎(chǔ)血壓和心率的影響

無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)試顯示，SHR-SED組大鼠收縮壓（SBP，193.8 ± 5.8 mmHg）顯著高于WKY組（129.4 ±5.6 mmHg，P < 0.05），而SHR-EX組大鼠SBP（150.8 ±6.8 mmHg）顯著低于SHR-SED組（P < 0.05），但仍高于WKY組 （P < 0.05）（圖1A）。 SHR-SED組心率（heart rate，428 ± 15 bpm）顯著高于WKY組（388 ± 12 bpm），SHR-EX組（394 ± 11 bpm） 顯著低于SHR-SED組，與WKY組比較無(wú)顯著差異（圖1B）。 這提示有氧運(yùn)動(dòng)能有效緩解高血壓，但不能使其降低至正常水平；有氧運(yùn)動(dòng)可削弱高血壓大鼠安靜心率的升高。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈收縮特性的影響

2.2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)KCl和NE誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響

無(wú)論是正常血壓組還是高血壓組，120 mM KCl和NE（10-5M）均可誘發(fā)腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)，各組間120 mM KCl誘發(fā)的最大收縮張力 （Kmax） 無(wú)顯著性差異。NE（10-5M）誘發(fā)的收縮張力標(biāo)準(zhǔn)化為%Kmax，可以發(fā)現(xiàn)在SHR-SED組最大 （134.3 ± 5.2 %Kmax）， 其次為SHR-EX組 （113.5 ± 3.8%Kmax）， 最小的為WKY組（105.8 ± 3.5 % Kmax）。

圖1 各組基礎(chǔ)血壓和心率比較

2.2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Rho激酶抑制劑Y-27632誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響

如圖2所示，Y-27632可誘發(fā)腸系膜動(dòng)脈呈濃度依賴性舒張。pD2為藥物半量最大反應(yīng)的平均有效濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，主要反映血管對(duì)藥物的敏感性。 引起50%最大舒張反應(yīng)Y-27632 的濃度的負(fù)對(duì)數(shù) （pD2） 分別是WKY：4.86 ± 0.16；SHR-SED：5.76 ± 0.05；SHR-EX：5.06 ± 0.15（各組n = 6），提示高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)Y-27632的敏感性增強(qiáng)，8周有氧運(yùn)動(dòng)可減弱高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)Y-27632的敏感性。

圖2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Y-27632誘發(fā)腸系膜上動(dòng)脈舒張的劑量-反應(yīng)曲線

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈RhoA-GTP蛋白表達(dá)的影響

如圖3A所示，本實(shí)驗(yàn)采用親和層析純化方法，得到了純度較高的復(fù)合物RhoA-GTP以及Total-RhoA蛋白，并且3組Total-RhoA含量無(wú)明顯差異。 與內(nèi)參β-actin相比，將WKY組作為1.00 ± 0.00，其SHR-SED和SHR-EX組的Total-RhoA含量分別為（1.02 ± 0.01，1.01 ± 0.01，各組n = 6）。 如圖3B所示，3組pulldown實(shí)驗(yàn)所得到的蛋白復(fù)合物RhoA-GTP相對(duì)含量有差異。 與WKY組相比，SHR-SED組和SHR-EX組腸系膜動(dòng)脈RhoA-GTP相對(duì)含量顯著增加 （P < 0.05）； 與SHR-SED組相比，SHREX組RhoA-GTP相對(duì)含量顯著減少（P > 0.05）。

圖3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA-GTP蛋白表達(dá)比較

3 討論

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變， 主動(dòng)脈和大動(dòng)脈血管順應(yīng)性變大，血管外周阻力減小[14]。 腸系膜動(dòng)脈為阻力血管，在全身的動(dòng)脈中占的比例最大，是形成全身外周阻力的主要血管[15]。 它的收縮和舒張可顯著影響胃腸等器官的血流量， 對(duì)正常血壓的維持及維持其它重要器官血液供應(yīng)發(fā)揮著不可替代的作用。研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)改善衰老大鼠心血管反應(yīng)性以及腸系膜動(dòng)脈舒縮功能[16]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)8周有氧運(yùn)動(dòng)，高血壓大鼠收縮壓明顯下降，在實(shí)驗(yàn)中我們使用去甲腎上腺素（NE）誘發(fā)腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)，NE通過(guò)與腎上腺素能受體結(jié)合， 可以對(duì)血管產(chǎn)生強(qiáng)烈的收縮作用。 本實(shí)驗(yàn)中有氧運(yùn)動(dòng)可有效減弱高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)NE的敏感性，但運(yùn)動(dòng)組仍顯著高于正常血壓對(duì)照組， 表明高血壓大鼠的血管對(duì)加壓物質(zhì)的敏感性較正常大鼠增強(qiáng)。 由此說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)可以作為輔助手段來(lái)控制血壓。

血管阻力增加是高血壓最重要的發(fā)病機(jī)制。 研究證明，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可以引起VSMC緊張度的改變，調(diào)節(jié)血管阻力[17]，因此，它與高血壓的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。近年有研究表明，在多種高血壓動(dòng)物模型中， 包括幼年尚未出現(xiàn)血壓升高的SHR中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的活性都被證實(shí)有所增強(qiáng)，這一現(xiàn)象是通過(guò)抑制MLCP活性， 引起MLC磷酸化水平升高，造成血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度反應(yīng)產(chǎn)生的。 長(zhǎng)期給予非低血壓劑量的Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾（fasudil）可以明顯抑制SHR冠狀血管病變形成，充分說(shuō)明Rho激酶參與了高血壓血管疾病的發(fā)生機(jī)制。 同樣，Rho激酶特異性抑制劑Y-27632可以阻斷Rho激酶的活性，減弱血管收縮，下調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）[18]，它被廣泛應(yīng)用于RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的研究中。 有研究證實(shí)Y-27632的使用降低了多種系統(tǒng)性高血壓大鼠模型的全身血壓[19]。 對(duì)比而言，同等劑量的Y-27632對(duì)正常血壓的動(dòng)物并沒(méi)有顯著影響。 本實(shí)驗(yàn)采用離體腸系膜動(dòng)脈微血管環(huán)， 并選用Y-27632來(lái)探討其中可能的機(jī)制，結(jié)果顯示，Y-27632（3×10-8～10-5M）可誘導(dǎo)腸系膜動(dòng)脈二級(jí)分支呈濃度依賴性舒張反應(yīng)， 由此說(shuō)明RhoA/Rho激酶信號(hào)通路很大程度上參與了高血壓的發(fā)病機(jī)制。

如今， 通過(guò)運(yùn)動(dòng)預(yù)防和治療高血壓已經(jīng)得到重視并大量研究，高血壓病是一種多因素變化的疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療方法也有多種，運(yùn)動(dòng)干預(yù)作為不可或缺的一種，不僅緩解了高血壓病的高壓狀態(tài)，還避免了降壓藥物的副作用，增進(jìn)機(jī)體的整體健康水平。運(yùn)動(dòng)對(duì)血管功能的調(diào)控目前日益受到人們的關(guān)注， 但大部分都集中在血管內(nèi)皮功能改善方面。以往研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管舒張物質(zhì)NO，增強(qiáng)內(nèi)皮依賴性舒張，以此來(lái)調(diào)節(jié)血管張力[20]。 而有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)VSMC結(jié)構(gòu)和功能有哪些影響，目前還不清楚。 本實(shí)驗(yàn)中高血壓運(yùn)動(dòng)組大鼠血管對(duì)Y27632的敏感性（pD2）大于正常血壓組， 但小于高血壓安靜組。 由此可以推斷，高血壓時(shí)血管對(duì)Y-27632的敏感性增強(qiáng)，有氧運(yùn)動(dòng)可以降低血管對(duì)Y-27632的敏感性。 因此，RhoA/Rho激酶在有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)VSMC功能重塑過(guò)程中起著非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓安靜組大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA-GTP的相對(duì)含量明顯高于正常血壓組大鼠，而高血壓運(yùn)動(dòng)組的相對(duì)含量較安靜組略有降低。 這提示RhoA參與了高血壓的發(fā)展進(jìn)程，高血壓時(shí)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路功能的增強(qiáng)可能與其RhoA的活化量增加有關(guān)，8周規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以防止更多的RhoA被激活，來(lái)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的活性，最終達(dá)到運(yùn)動(dòng)降壓的目的。

RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌收縮， 抑制血管細(xì)胞的分化、 增殖、 遷移及分泌等許多方面影響血壓。 在VSMC內(nèi)的RhoA蛋白，被上游的信號(hào)分子激活，向下游的ROCK發(fā)出活化信號(hào)——花生四烯酸，Rho激酶自身發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化而激活，激活的ROCK對(duì)MLCP的MBS的697位Thr進(jìn)行磷酸化修飾， 使MLCP失活， 失活的MLCP不能將MLC脫磷酸化， 于是胞漿內(nèi)MLC磷酸化水平上升，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，最終導(dǎo)致VSMC收縮。 Rho蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命過(guò)程，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮的重要分子[21]。 活化的RhoA形式是與GTP結(jié)合的RhoA-GTP，RhoA活化誘導(dǎo)了下游重要的效應(yīng)器如Rho激酶后，影響細(xì)胞的骨架重組和基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[22]。 Otto等[23]利用去膜的平滑肌研究發(fā)現(xiàn)， 加入RhoA的顯性激活突變體Val14RhoA能顯著增強(qiáng)氯化乙酰膽堿誘導(dǎo)的平滑肌收縮的鈣敏化，而且這種效應(yīng)能被C3抑制，說(shuō)明RhoA參與了平滑肌收縮的鈣敏化機(jī)制。 目前已證實(shí)RhoA是收縮蛋白鈣敏化的主要調(diào)節(jié)物[24]。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明，RhoA表達(dá)量或活性的改變與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)， 在收縮型平滑肌細(xì)胞，RhoA的表達(dá)及活性均增強(qiáng)， 而合成型RhoA的表達(dá)則維持在較低水平[25]；RhoA還通過(guò)影響AngⅡ等血管活性物質(zhì)影響交感神經(jīng)活性，通過(guò)中樞調(diào)節(jié)血壓。

4 總結(jié)

有氧運(yùn)動(dòng)可減弱高血壓所致的RhoA/Rho激酶信號(hào)通路RhoA-GTP上調(diào)，這可能是有氧運(yùn)動(dòng)改善腸系膜動(dòng)脈舒縮功能的重要機(jī)制之一。

[1] 李志利， 姜世忠. RhoA-ROK 通路在平滑肌收縮中的作用[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2006，36（4）：341-344.

[2] Maeng J，Sheverdin V，Shin H，et al. Up-Regulation of Rhoa/Rho kinase pathway by translationally controlled tumor protein in vascular smooth muscle Cells [J]. Int J Mol Sci，2014，15（6）：10365-10376.

[3] Moreno -Domínguez A，El -Yazbi AF，Zhu HL，et al. Cytoskeletal reorganization evoked by Rho-associated kinaseand Protein Kinase C-catalyzed phosphorylation of Cofilin and heat shock protein 27，respectively，contributes to myogenic constriction of rat cerebral arteries [J]. J Biol Chem，2014，289（30）：20939-20952.

[4] Uehata M，Ishizaki T，Satoh H，et al. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associa ted protein kinase in hypertension[J]. Nature，1997，389：990-994.

[5] Mukai Y，Shimokawa H，Matoba T，et al. Involvement of Rhokinase in hypertensive vascular disease：a novel therapeutic target in hypertension[J]. FASEB J，2001，15：1062-1064.

[6] Uehata M. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension [J]. Nature，1997，389：990-994.

[7] Ito K，Hirooka Y，Sakai K，et al. RhoA/Rho-kinase pathway in brain stem contributes to blood pressure regulation via sympathetic nervous system：possible involvement in neural mechanisms of hypertension [J]. Circ Res，2003，92：1337-1343.

[8] Shimokawa H，Morishige K，Miyata K，et al. Long-term inhibition of Rho-kinase induces a regression of arteriosclerotic coronary lesions in a porcine model in vivo[J]. Cardiovas Res，2001，51（1）：169-177.

[9] Higashi M，Shimokawa H，Hattori T，et al. Long-term inhibition of Rho-kinase suppresses angiotensinⅡinduced cardiovascular hypertrophy in rats in vivo：effect on endothelial NAD（P）H oxidase system[J]. Circ Res，2003，93：767-775.

[10] Ming XF，Viswambharan H，Barandier C，et al. Rho GTPase/Rho kinase negatively regulates endothelial nitric oxide synthase phosphorylation through the inhibition of protein kinase B/Akt in human endothelial cells [J]. Mol Cell Biol，2002，22：8467-8477.

[11] 袁僑英，覃數(shù)，司良毅，等. 辛伐他汀對(duì)急性心肌梗死大鼠RhoA 表達(dá)及心室重塑的影響 [J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（12）：1170-1172.

[12] Agarwal D，Welsch MA，Keller JN，et al. Chronic exercise modulates RAS components and improves balance between pro-and anti-inflammatory cytokines in the brain of SHR[J].Basic Res Cardiol，2011，106：1069-1085.

[13] Roque FR，Briones AM，García-Redondo AB，et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension[J]. Br J Pharmacol，2013，168（3）：686-703.

[14] Horta PP，de Carvalho JJ，Mandarim-de-Lacerda CA. Exercise training attenuates blood pressure elevation and adverse remodeling in the aorta of spontaneously hypertensive rats[J].Life Sci，2005，77（26）：3336-3343.

[15] Nichols AJ，Wilson AC，Hiley CR. Effects of sympathectomy with 6-hydroxydopamine on cardiac output and its distribution in the rat [J]. Eur J Pharmacol，1985，109：263-268.

[16] 劉曉東，石麗君，王德剛. 運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠心血管功能和腸系膜動(dòng)脈反應(yīng)性的影響 [J]. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（4）：316-322.

[17] Wettschureck N，Offermanns S. Rho/Rho -kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology [J]. J Mol Med，2002，80：629-638.

[18] Huh YH，Kweon HS，Kitazawa T. ROCK inhibitor，Y-27632，reduces FBS-induced structural alteration in organ-cultured mesenteric artery[J]. JAST，2013，4（1）：15.

[19] Himpens B，Kitazawa T，Somlyo AP. Agonist-dependent modulation of Ca2+sensitivity in rabbit pulmonary artery smooth muscle[J]. Pflügers Arch，1990，417：21-28.

[20] Niebauer J，Cooke JP. Cardio vascular effects of exercise：role of endothelial shear stress [J]. J Am Coll Cardiol，1996，28：1652-1660.

[21] Bryan BA，Dennstedt E，Mitchell DC，et al. RhoA/ROCK signaling is essential for multiple aspects of VEGF-mediated angiogenesis[J]. FASEB J，2010，24，3186-3195.

[22] Bishop AL，Hall A. Rho GTPases and their effector proteins[J]. Biochem J，2000，348，2：241-255.

[23] Otto B，Steusloff A，Just I，et al. Role of Rho proteins in carbachol -induced contractions in intact and permeabilized guinea-pig intestinal smooth muscle[J]. J Physiol，1996，496，317-329.

[24] Somlyo AP，Somlyo AV. Ca2+sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin Ⅱ：modulated by G proteins，kinases，and myosin phosphatase[J]. Physiol Rev，2003，83：1325-1135.

[25] Manickam N，Patel M，Griendling KK，et al. RhoA/Rho kinase mediates TGF-β1-induced kidney myofibroblast activation through Poldip2/Nox4-derived reactive oxygen species[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（2）：F159-171.