高克非，曾 根，胡昀昀，卜亞麗

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510405；2.海南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 海口 570203)

三氧化二砷聯(lián)合COX-2抑制劑塞來昔布
對高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞系HO-8910PM的體內(nèi)、體外抗腫瘤實驗研究

高克非1，曾 根2，胡昀昀1，卜亞麗1

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510405；2.海南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 ?？?570203)

目的 探索三氧化二砷和COX-2抑制劑塞來昔布對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞的聯(lián)合抗腫瘤效應。方法在體外實驗中，三氧化二砷和塞來昔布作用于HO-8910PM細胞后，采用噻唑蘭(MTT)比色實驗、Hoechest33258凋亡染色實驗、流式細胞術(shù)等方法在細胞水平檢驗這兩種藥物單藥及聯(lián)合的增殖抑制和誘導凋亡作用。體內(nèi)實驗中，通過腋窩皮下注射HO-8910PM細胞建立BALB/c-nu裸鼠移植瘤模型，并隨機分為陰性對照組、AS2O3單藥組、Celecoxib單藥組以及AS2O3聯(lián)合Celecoxib組等四個處理組，AS2O3和Celecoxib分別采用腹腔灌注和灌胃的方法，實驗結(jié)束時稱取各組移植瘤的瘤重，計算抑瘤率并進行組間統(tǒng)計學比較分析。結(jié)果三氧化二砷和塞來昔布對HO-8910PM細胞株均具有劑量依賴性的增殖抑制作用，IC50值分別為65.48 μmol/L和49.13 μmol/L。兩藥聯(lián)合后的增殖抑制率均大于任一單藥抑制率且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而聯(lián)合用藥的q值分別為3.23和2.42，均大于1.15，提示兩藥聯(lián)合具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應。Hoechest33258凋亡染色和流式細胞儀檢測從凋亡角度進一步證實了MTT的實驗結(jié)果。裸鼠實驗中，聯(lián)合用藥組相對于單藥組的抗腫瘤效應未顯示出統(tǒng)計學差異，但聯(lián)合用藥組的平均瘤重仍為最小。結(jié)論三氧化二砷聯(lián)合塞來昔布對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞HO-8910PM具有明確的協(xié)同抗腫瘤作用，該用藥方案對高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌具有進一步的研究價值。

三氧化二砷；塞來昔布；卵巢癌；裸鼠

三氧化二砷(AS2O3)是一個由血液病走向?qū)嶓w瘤的多靶點抗腫瘤藥，除對急性早幼粒細胞白血病的臨床治療已取得世界公認的效果外，它對肝癌、卵巢癌等各種實體瘤均具備良好的抗腫瘤實驗效應，其療效機制包括清除腫瘤干細胞、誘導凋亡、提高細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的水平、促進分化、抑制NF-κB等，其中誘導凋亡為其主要作用機制[1-3]。塞來昔布(Celecoxib)是一個以環(huán)氧化酶-2(COX-2)為靶點的分子靶向藥物，對卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細胞肺癌、泌尿系及消化道腫瘤等均具有增殖抑制作用，目前認為它的抗腫瘤作用機制包括依賴COX-2和非依賴COX-2的兩種途徑，最終主要表現(xiàn)為增殖抑制和誘導凋亡效應，并且美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)批準該藥可用結(jié)腸癌、乳腺癌等病種的臨床治療[4-7]。

劉定勝等[8]于2011年報道塞來昔布與三氧化二砷聯(lián)合對慢性粒細胞白血病原代細胞具有協(xié)同抑制作用，而本課題組將AS2O3和Celecoxib聯(lián)合應用于非高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞株OVCAR-3也得到了相似的研究結(jié)果[9]，但對高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞是否具有相同的協(xié)同效應目前尚無報道，因此本研究以高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞株HO-8910PM為研究對象進一步驗證這一假設(shè)是否成立。

1 資料與方法

1.1 細胞系及主要試劑 人高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞株HO-8910PM購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。RPMI-1640培養(yǎng)液和優(yōu)級胎牛血清(FBS)均為美國Gibco公司產(chǎn)品。Celecoxib標準品購自廣州優(yōu)瓦儀器有限公司(純度99.5%)，以二甲基亞砜(DMSO)6 ml溶解200 mg備用。亞砷酸注射液(10 ml/10 mg)購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司。胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechest33258均為美國Sigma公司產(chǎn)品。酶標儀(BIO-TEK ELX800)為美國寶特公司產(chǎn)品。倒置熒光顯微鏡及其拍照系統(tǒng)為Olympus公司產(chǎn)品。流式細胞儀(ELITE型)為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。SPF級、雌性BALB/C-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞株HO-8910PM于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。

1.3 MTT增殖抑制實驗 取處于對數(shù)生長期的HO-8910PM細胞，以5.0×103個/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換含不同濃度的Celecoxib和AS2O3的培養(yǎng)液。單藥試驗中Celecoxib等差設(shè)置21.85～109.25 μmol/L 5個藥物濃度，AS2O3等比設(shè)置9.92～158.73 μmol/L 5個藥物濃度。聯(lián)合用藥實驗中取9.92 μmol/L的AS2O3和10.93 μmol/L的Celecoxib進行聯(lián)合、19.84 μmol/L的AS2O3和21.85 μmol/L的Celecoxib進行聯(lián)合。實驗中每孔最終反應體系中DMSO濃度小于3‰。細胞培養(yǎng)44 h后加入MTT溶液(10 mg/ml)10 μl，再放入培養(yǎng)箱反應4 h，吸凈孔內(nèi)液體，再加入DMSO 100 μl/孔，振蕩10 min，上酶標儀測定波長為570 nm的吸光值(A570)。實驗重復3次，取3次實驗結(jié)果的平均值作為實驗結(jié)果。單藥實驗中，以藥物濃度為橫軸，細胞增殖抑制率為縱軸，繪制細胞生長曲線。腫瘤細胞增殖抑制率=[1-(物處理組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)]×100%。按金氏公式[q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea× Eb)]計算所得q值進一步評價兩種藥物合用是否具有協(xié)同或拮抗效應，式中E(a+b)為聯(lián)合用藥的有效率，Ea和Eb分別為兩種藥物單藥的有效率。q值在0.85～1.15范圍為兩藥合用呈單純相加效應，q值大于1.15為兩藥合用具有協(xié)同效應，q值小于0.85為兩藥合用具有拮抗效應。

1.4 Hoechest33258凋亡染色實驗 取對數(shù)生長期的HO-8910PM細胞按2.2×105/孔的密度接種于6孔板并培養(yǎng)24 h后，加入相應藥液繼續(xù)培養(yǎng)。Celecoxib單藥實驗設(shè)21.85 μ mol/L、43.70 μ mol/L、65.55 μmol/L三個濃度，AS2O3單藥實驗設(shè)9.92 μmol/L、19.84 μmol/L、39.68 μmol/L三個濃度，藥物聯(lián)合實驗取9.92 μmol/L AS2O3和21.85 μmol/L Celecoxib進行聯(lián)合，并均設(shè)陰性對照組。以藥液繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h后經(jīng)固定、洗滌，再以10 μg/ml的Hoechest33258溶液避光染色10 min，置于倒置熒光顯微鏡下拍照。判斷凋亡的鏡下形態(tài)為細胞體積縮小、核固縮、染色質(zhì)邊集、凋亡小體形成等。

1.5 流式細胞儀凋亡檢測實驗 HO-8910PM細胞培養(yǎng)24 h后以9.92 μmol/L AS2O3、21.85 μmol/L Celecoxib單藥及聯(lián)合培養(yǎng)液處理細胞48 h，并設(shè)陰性對照組。細胞收集、洗滌、固定、離心以及RNAase和PI染液處理，行流式檢測，觀察凋亡比例，實驗重復3次。

1.6 荷瘤裸鼠的腫瘤生長抑制實驗 取處于對數(shù)生長期的HO-8910PM細胞以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成4×107/ml的單細胞懸液，每只裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種200 μl，最終選取合格荷瘤裸鼠共26只分為四組，即陰性對照組(7只)、Celecoxib單藥組(7只)、AS2O3單藥組(6只)、AS2O3聯(lián)合Celecoxib組(6只)進行實驗。經(jīng)統(tǒng)計學分析，實驗前各組裸鼠的實驗前體重和腫瘤大小方差齊(P=0.439和0.401)，且差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明各組裸鼠實驗前條件均衡。給藥劑量和方法參照既往相關(guān)文獻報道并取較低的安全劑量，亞砷酸注射液以生理鹽水稀釋成0.2 mg/ml，按2 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射給藥。塞來昔布按20 mg·kg-1·d-1劑量灌胃給藥。兩種藥物均為每日一次，連用6 d，休息1 d，共4周。對照組為同等容量的生理鹽水灌胃和腹腔注射。用藥期間動態(tài)觀察給藥期間裸鼠體重和腫瘤大小的變化。實驗結(jié)束時，將所有裸鼠以頸髓離斷的方法處死，解剖出瘤塊，稱瘤重。抑瘤率IR(%)=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，IC50值的計算采用概率單位法。樣本間均數(shù)的比較采用組間t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗顯示的單藥增殖抑制及雙藥協(xié)同抗腫瘤作用 AS2O3和Celecoxib對高轉(zhuǎn)移性的HO-8910PM細胞株均具有劑量依賴性的增殖抑制作用，AS2O3的半數(shù)抑制濃度(IC50)值是65.48 μmol/L，Celecoxib的IC50值是49.13 μmol/L(圖1 A、1B)。聯(lián)合實驗中，9.92 μmol/L AS2O3單藥的抑制率為(4.3±0.8)%，10.93 μmol/L Celecoxib單藥的抑制率為(7.8±1.2)%，聯(lián)合用藥的抑制率為(38.2±2.0)%，兩單藥與聯(lián)合用藥比較的t值分別為14.48和12.68，P＜0.05，按金正均公式計算此聯(lián)合用藥的q值為3.23；19.84 μmol/L AS2O3單藥的抑制率為(18.2±1.5)%，21.85 μmol/L Celecoxib單藥的抑制率為(13.5±1.6)%，聯(lián)合用藥的抑制率為(70.0±1.9)%，兩單藥與聯(lián)合用藥比較的t值分別為26.24和27.75，P＜0.05，按金氏公式計算的q值為2.42(圖1C)。由此可見，兩藥聯(lián)合后的增殖抑制率均大于同濃度AS2O3和Celecoxib單藥的抑制率，且P＜0.05，q＞1.15，提示兩藥聯(lián)合具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應。

圖1 AS2O3和Celecoxib單藥及聯(lián)合對HO-8910PM細胞株的增殖抑制作用

2.2 AS2O3和Celecoxib單藥及聯(lián)合促進凋亡的形態(tài)學表現(xiàn) HO-8910PM細胞經(jīng)三個藥物濃度的AS2O3(圖2B～2D)和三個藥物濃度的Celecoxib (圖2 F～H)單藥作用，鏡下均顯示濃度依賴的細胞凋亡增加，可觀察到凋亡小體形成、核固縮、染色質(zhì)邊集等細胞凋亡形態(tài)；在聯(lián)合用藥實驗中，可見兩個單藥處理組凋亡細胞較少，而聯(lián)合用藥組凋亡明顯增多(圖2J～2L)。

2.3 AS2O3和Celecoxib聯(lián)合促進凋亡的流式細胞術(shù)結(jié)果 HO-8910PM細胞株經(jīng)9.92 μmol/LAS2O3作用后凋亡率為(4.2±1.0)%，21.85 μmol/L Celecoxib作用后凋亡率為(12.0±2.5)%，兩藥聯(lián)合作用后的凋亡率為(55.2±3.0)%，兩個單藥組與聯(lián)合用藥組比較的t值分別為38.2和30.9，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)見圖3。

2.4 荷瘤裸鼠實驗中的腫瘤生長抑制情況 實驗過程中各組裸鼠均無未見致死性毒性反應。各處理組腫瘤的體積和裸鼠體重均隨時間的延長而增加，且趨勢相同，均為對照組增加的較快，聯(lián)合用藥組增加的最慢，Celecoxib組和AS2O3組介于對照組和聯(lián)合組之間。實驗結(jié)束后，剖出瘤塊稱取瘤重，各組平均瘤重、抑瘤率以及各用藥組與對照組比較的組間P值均見表1。由此可見，各檢驗的P值均大于0.05，差異無統(tǒng)計學意義，但仍可見聯(lián)合用藥組在各組中瘤重最小，統(tǒng)計學檢驗的P值也最小(圖4)。

圖3 流式細胞術(shù)檢測AS2O3和Celecoxib單藥及聯(lián)合作用于HO-8910PM細胞株的凋亡比例

圖4 荷瘤裸鼠實驗中的BALB/c-nu裸鼠和移植瘤標本

表1 裸鼠實驗結(jié)束時的各組平均瘤重、抑瘤率比較(±s)

表1 裸鼠實驗結(jié)束時的各組平均瘤重、抑瘤率比較(±s)

組別對照組Celecoxib組AS2O3組聯(lián)合用藥組平均瘤重(g) 0.899±0.156 0.568±0.158 0.585±0.127 0.437±0.099抑瘤率(%) 0 36.82 34.93 51.39P值0.594 0.781 0.148

3 討論

卵巢癌是死亡率最高、預后最差的一類婦科惡性腫瘤，化療在卵巢癌的治療中與手術(shù)相輔相承，具有十分重要的地位，作為臨床研究的熱點，卵巢癌化療方面不斷有新的探索和嘗試。

三氧化二砷(AS2O3)是一個以誘導凋亡作用為主的多靶點藥物，對以急性早幼粒細胞白血病(APL)為代表的各種血液系統(tǒng)惡性疾病具有顯著的療效，近年來針對卵巢癌、肝癌等多種實體瘤有效的研究報道也不斷涌現(xiàn)[1，3，10-11]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是花生四烯酸代謝途徑中合成各種前列腺素(PGs)的關(guān)鍵限速酶，包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中都存在COX-2高表達[12]，因此，選擇性的COX-2抑制劑例如塞來昔布(Celecoxib)在卵巢癌方面的研究報道也不斷出現(xiàn)，特別是該藥聯(lián)合其他化療藥物兩方面大多數(shù)取得了較為滿意的結(jié)果[7，13-14]，而也有報道該藥物的誘導凋亡效應更多的與非COX-2靶點的抑制有關(guān)[4]。

劉定勝等[8]在2011年曾報道塞來昔布與三氧化二砷聯(lián)合對慢性粒細胞白血病原代細胞具有協(xié)同抑制作用，而胃癌、白血病的相關(guān)研究表明AS2O3處理后細胞內(nèi)COX-2的表達明顯降低[15-16]，甚至有研究認為COX-2是影響AS2O3作用后的細胞是否可以繼續(xù)存活的關(guān)鍵蛋白[17]，根據(jù)以上研究結(jié)果我們認為，三氧化二砷聯(lián)合與塞來昔布的協(xié)同抗腫瘤效應既有直接研究證據(jù)的支持，又有COX-2作為潛在聯(lián)合作用靶點的確認，是一個在實體瘤方面值得廣泛深入研究的一個用藥方案。

上皮性卵巢癌在病理分化上有中高分化和低分化之分，臨床生物學行為上有高轉(zhuǎn)移和非高轉(zhuǎn)移之別，本課題組將兩藥聯(lián)合應用于非高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞OVCAR-3也得到了具有協(xié)同抗腫瘤作用的實驗結(jié)果，但在高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌中是否具有同樣的效應目前尚無報道，因此，我們以高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞株HO-8910PM為研究對象，將AS2O3與Celecoxib的聯(lián)合效應在細胞及裸鼠水平分別進行了檢驗。

本研究中MTT實驗結(jié)果顯示，9.92 μmol/L AS2O3的單藥抑制率為(4.3±0.8)%，10.93 μmol/L Celecoxib單藥的抑制率為(7.8±1.2)%，聯(lián)合用藥的抑制率為(38.2±2.0)%；19.84 μmol/L的AS2O3單藥的抑制率為(18.2±1.5)%，21.85 μmol/L Celecoxib的單藥抑制率為(13.5±1.6)%，聯(lián)合用藥的抑制率為(70.0±1.9)%，由此可見聯(lián)合用藥的抑制率均遠大于組內(nèi)單藥的抑制率(P＜0.05)。按金正均公式計算兩聯(lián)合用藥組的q值分別為3.23和2.42，遠大于1.15，提示具有顯著的相同抗腫瘤作用。倒置熒光顯微鏡下觀察Hoechest33258凋亡染色情況，結(jié)果顯示兩個單藥處理組凋亡細胞較少，聯(lián)合用藥組凋亡明顯多于單藥組。流式細胞儀進一步檢測了凋亡比例情況，兩藥單獨作用的凋亡比例分別為(4.2±1.0)%和(12.0±2.5)%，兩藥聯(lián)合作用后的凋亡率為(55.2±3.0)%，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在裸鼠實驗中，為避免出現(xiàn)不可控的毒副作用，兩藥的給藥劑量均為各文獻報道中的較低劑量，而本課題的裸鼠研究顯示了陰性的實驗結(jié)果，分析可能是與該劑量選擇有關(guān)，但盡管如此，聯(lián)合用藥組仍為平均瘤重最低組。以上實驗結(jié)果證明，AS2O3與Celecoxib聯(lián)合應用，無論對非高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌細胞還是高轉(zhuǎn)移性的卵巢癌均具有協(xié)同抗腫瘤效應。

在兩藥的協(xié)同抗腫瘤機制上有研究已給我們一定的提示，例如Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞系SGC-7901經(jīng)AS2O3作用后COX-2的表達下調(diào)，再繼續(xù)給予塞來昔布作用后，COX-2的表達則進一步下調(diào)，并且與AS2O3單藥處理時比較差異有統(tǒng)計學意義，這提示COX-2確定為二者協(xié)同作用的靶點。此外，AS2O3和Celecoxib均可抑制腫瘤細胞NF-κB的表達[18-19]、下調(diào)Survivin的表達[20-21]，提示NF-κB信號通路和Survivin信號通路也是AS2O3和Celecoxib的聯(lián)合作用靶點。本課題組下一步將對三氧化二砷和塞來昔布的聯(lián)合作用機制進行深入探討，并調(diào)整用藥劑量進一步重復驗證裸鼠體內(nèi)抗腫瘤實驗，以期得到一個較為理想的實驗結(jié)論。

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In vitro and in vivo anti-neoplasm effects of arsenic trioxide combined with COX-2 inhibitor on highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.

GAO Ke-fei1,ZENG Gen2,HU Yun-yun1,BU Ya-li1. 1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Hainan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital,Haikou 570203,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the anti-neoplasm effects of the combination of arsenic trioxide and COX-2 inhibitor(celecoxib)on highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.MethodsIn thein vitrotest, the HO-8910PM cells were treated with AS2O3or celecoxib or both agents.Cell proliferation was assessed by MTT assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry and Hoechest33258 fluorescence staining.In thein vivotest,the nude mice bearing transplanted tumors were divided into control group,AS2O3group,celecoxib group,and AS2O3plus celecoxib group,and were intraperitoneally injected with AS2O3and(or)intragastrically administered with celecoxib. The weight of xenografts was measured after treatment and the inhibition rate was calculated.ResultsDose-dependent anti-proliferative effects were observed in MTT test.The IC50value of AS2O3was 65.48 μmol/L,and that of celecoxib was 49.13 μmol/L.When celecoxib and AS2O3were applied simultaneously,the proliferative inhibition rate was higher than that of the group treated with celecoxib or AS2O3alone(P＜0.05),and theqvalues were 3.23 and 2.42,respectively,both of which were greater than 1.15.The apoptotic results of flow cytometry and Hoechest33258 fluorescence staining proved the prior results from MTT test.In thein vivotest,there were no significant differences between single-agent group and two-agent group,but the average tumor weight of the two-agent group was also the minimum in the four groups.ConclusionThere are synergistic effects when arsenic trioxide and celecoxib are used in combination in highly metastatic ovarian cancer cell line HO-8910PM.The combined regimen of the two agents is worth further research.

Arsenic trioxide;Celecoxib;Ovarian cancer;Nude mice

R-332

A

1003—6350（2015）14—2032—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0736

2015-01-21)

高克非。E-mail:schsunms@.163.com