胡艷吳瑜瑜

作者單位: 362000福州市，福建醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院(胡艷現(xiàn)工作單位為長沙愛爾眼科醫(yī)院)

纖維連接蛋白對原發(fā)性開角型青光眼小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1表達的影響

胡艷吳瑜瑜

作者單位: 362000福州市，福建醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院(胡艷現(xiàn)工作單位為長沙愛爾眼科醫(yī)院)

【摘要】目的探討纖維連接蛋白(FN)對體外培養(yǎng)的原發(fā)性開角型青光眼(POAG)患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1表達及細胞存活的影響。方法對照實驗研究，體外培養(yǎng)POAG患者小梁網(wǎng)細胞，分別加入不同濃度的FN培養(yǎng)。采用免疫細胞化學法觀察各組細胞整合素α4β1的表達及細胞存活情況。結果隨著FN濃度增加，整合素α4β1表達增強;在FN低濃度范圍內(nèi)陽性細胞面積增多。結論FN影響小梁網(wǎng)細胞肌動蛋白骨架及其細胞連接，改變來參與房水流出的調(diào)節(jié)過程。

【關鍵詞】小梁網(wǎng)細胞;原發(fā)性開角型青光眼;纖維連接蛋白;整合素α4β1;免疫細胞化學法

項目來源:福建省教育廳科技項目(編號: JA07107) ;泉州市技術研究與開發(fā)項目(編號: 2007Z18)

E-mail: wuyy62@ tom.com

纖維連接蛋白(FN)在原發(fā)性開角型青光眼(POAG)患者小梁網(wǎng)細胞中高表達，提示FN對POAG的發(fā)生可能起重要作用［1］。小梁網(wǎng)細胞骨架對調(diào)節(jié)房水流出起一定作用，其主要成分肌動蛋白是通過改變小梁網(wǎng)細胞收縮特性，削減小梁網(wǎng)細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的連接［2］，本研究采用免疫細胞化學方法檢測FN對POAG病態(tài)小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1分泌的調(diào)節(jié)及細胞存活的影響，探討其與POAG發(fā)病機制的關系。

1　材料與方法

1.1標本來源與處理體外細胞培養(yǎng)組織塊來自福建醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院眼科2008年9月至2009 年6月確診的3例POAG患者，對小梁切除術后取得的帶小梁網(wǎng)組織塊進行細胞培養(yǎng)，符合人體細胞實驗的倫理學標準?；颊吣挲g分別為45、48、51歲，無高血壓、糖尿病、傳染性和遺傳性疾病史。

1.2主要試劑及方法UltraSensitive TMSP超敏試劑盒，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。纖維連接蛋白購自CHMICON公司，整合素α4β1抗體購自ABCAM公司。在6孔培養(yǎng)板上鋪蓋玻片，用不同濃度的FN(0、5、10、20、40、100 μg/ml)包被，將小梁網(wǎng)細胞接種于6孔板，每組2個復孔，調(diào)整細胞濃度為2.5×104個/ml。無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d后，使細胞同步化，取出蓋玻片，PBS充分漂洗。然后按照Ultra SensitiveTM SP超敏試劑盒實驗步驟操作，直至二氨基聯(lián)苯胺顯色。

1.3結果判斷鏡下觀察整合素α4β1的表達，以出現(xiàn)棕色染色為陽性標準，實驗重復3次。封片后每張切片隨機取10個視野輸入計算機，采用MetaMorph免疫組化顯微圖象分析系統(tǒng)在200倍視野范圍隨機選取10個視野計算平均吸光度值。

1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，進行one-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1表達的影響隨著FN濃度增加，整合素α4β1表達增強。在5 μg/ml纖維連接蛋白培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細胞細胞核染色為藍色，細胞胞漿為藍色可見淡棕色顆粒，表達很少，在10 μg/ml纖維連接蛋白培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細胞胞漿棕色加深，隨著纖維連接蛋白的濃度的增加，細胞核始終為藍色，細胞胞漿為棕色逐漸加深。見表1，圖1。

2.2FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞存活的影響隨著FN濃度增加，在FN低濃度范圍內(nèi)(0～100 μg/ml)陽性細胞面積增多。見表2。

3　討論

整合素由不同α與β亞基組成，α亞基與配體識別有關，β亞基將信號傳導至細胞骨架，是許多細胞增生和遷移的基礎［3］。FN是小梁網(wǎng)組織的細胞外基質(zhì)主要成分，廣泛存在于Schlemm管內(nèi)壁的基底膜和小梁網(wǎng)近管組織，并且是房水的一種可溶性蛋白，是細胞外基質(zhì)重要組成部分。小梁網(wǎng)細胞的黏附及肌動蛋白的收縮主要由FN上兩個特殊的區(qū)域調(diào)節(jié): CellⅠ結合域和HepⅡ結合域［4］。HepⅡ結合域主要與整合素

表1　FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1表達的影響　±s

表1　FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1表達的影響　±s

注:與0比較，*P＜0.05;與5比較，#P＜0.05;與10比較，△P＜0.05;與20比較，☆P＜0.05;與40比較，▲P＜0.05

FN(μg/ml)0510　20　40　100 OD　0.231±0.001　0.232±0.005*　0.245±0.003* #　0.263±0.005* #△　0.276±0.004* #△☆　0.385±0.019* #△▲

表2　FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1陽性面積表達的影響　±s

表2　FN對POAG患者小梁網(wǎng)細胞整合素α4β1陽性面積表達的影響　±s

注:與0比較，*P＜0.05;與5比較，#P＜0.05;與10比較，△P＜0.05;與20比較，☆P＜0.05;與40比較，▲P＜0.05

FN(μg/ml)0510　20　40　100 OD　0.1202±0.012　0.1218±0.013*　0.1346±0.016* #　0.1419±0.012* #△　0.1679±0.011* #△☆　0.21993±0.019* #△▲

圖1　不同濃度的FN處理后的POAG患者小梁網(wǎng)細胞(SP×200)

α4β1結合促進黏著斑和張力絲的形成，利用肌動蛋白骨架的改變調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓。

本研究中小梁網(wǎng)細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化后，盡量排除血清中其他生長因子對細胞生物學特性的干擾。每張標本分別取同一光照強度，10個隨機視野，最大程度的減小誤差，從而增加實驗結果的可信度。結果表明，F(xiàn)N濃度為0～100 μg/ml內(nèi)隨著濃度的增加，整合素α4β1表達增加，與包被濃度呈正相關; FN濃度為0～100 μg/ml內(nèi)隨濃度的增加，細胞存活增加。原因可能為纖維連接蛋白與整合素α4β1結合，兩者相互協(xié)同信號可促進小梁網(wǎng)中的肌動蛋白交聯(lián)網(wǎng)狀結構形成:刺激張力絲形成和黏附斑激酶磷酸化，肌動蛋白和微絲蛋白重組，均使細胞骨架發(fā)生改變［3］。細胞骨架含量、成分以及質(zhì)量異常均可使小梁網(wǎng)細胞的形態(tài)發(fā)生改變，影響小梁網(wǎng)的收縮和伸展，最終影響房水循環(huán)通路［5］。

張力絲是細胞內(nèi)長而直的網(wǎng)狀結構，常與細胞的長軸大致平行并貫穿于細胞的全長，由大量的微絲束組成，點黏附復合體的黏附作用是通過張力絲、纖維連接蛋白和整合素a4β1來實現(xiàn)細胞與細胞外基質(zhì)之間的連接作用，紐蛋白是點黏附復合體主要的黏附蛋白，一端通過其他黏附分子與細胞質(zhì)膜連接，另一端與微絲束它還和細胞與細胞底物的附著和細胞與細胞之間的連接功能有關［6］。點復合黏附體內(nèi)的紐蛋白將肌動蛋白錨于細胞膜上，對微絲束的固定起著穩(wěn)定作用，張力纖維活動減小，細胞間隙增大，房水外流阻力減少。整合素a4β1與纖維連接蛋白結合信號刺激黏附斑激酶磷酸化，黏附斑的收縮性增強，可使其周圍小梁網(wǎng)間隙增大，房水外流阻力減少，還能調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細胞的黏附強度和收縮力［7］。

FN能調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓，并且處于一個動態(tài)平衡過程。纖維連接蛋白與整合素α4β1結合，在一定濃度范圍上調(diào)整合素α4β1，刺激黏著斑和張力絲的形成，利用肌動蛋白骨架的改變來調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓。但目前FN在小梁網(wǎng)細胞的效能以及如何調(diào)節(jié)房水外流阻力來改變眼內(nèi)壓的作用機制尚未完全清楚，需要進一步研究。

參考文獻

1李高堅.青光眼的臨床研究進展與發(fā)展趨勢.當代醫(yī)學，2012，10: 13-14

2張嫻，袁援生.原發(fā)性開角型青光眼基因基礎研究.當代醫(yī)學，2011，8: 37-38.

3Filla MS，Schwinn MK，Sheibani N，et al.Regulation of cross-linked actin network(CLAN) formation in human trabecular meshwork(HTM) cells by convergence of distinct beta1 and beta3 integrin pathways.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50: 5723-5731.

4Faralli JA，Schwinn MK，Gonzalez JM Jr，et al.Functional properties of fibronectin in the trabecular meshwork.Exp Eye Res，2009，88: 689-693.

5Peterson JA，Peters DM.Heparin II (HepII) domain of fibronectin modulates rho mediated events in proliferating human trabecular meshwork (HTM) cells via α41 Integrin.Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45: EAbstract 4369.

6Schwinn MK，Gonzalez JM Jr，Gabelt BT，et al.Heparin II domain of fibronectin mediates contractility through an alpha4beta1 co-signaling pathway.Exp Cell Res，2010，316: 1500-1512.

7Faralli JA，Peters JM，Newman JR，et al.Effect of heparin II domain of fibronectin on actin cytoskeleton and adherens junctions in human trabecular meshwork cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47: 2924-2931.

(收稿日期:2014－08－19)

通訊作者:吳瑜瑜，362000福州市，福建醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.07.034

【文章編號】1002－7386(2015) 07－1060－02

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 775.2