劉清池 王淑珍 馮壽岐 馬傳寶 張振會 王榮孝 熊建軍 龐宇慧 張慧敏

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是一種因免疫失衡導(dǎo)致血小板破壞加速的出血性疾病，以血小板數(shù)量減少和皮膚黏膜出血為主要表現(xiàn)，嚴重時可引起內(nèi)臟出血甚至死亡［1-3］。目前該病發(fā)病確切機制尚不明確，一般認為與患者機體免疫功能失調(diào)、免疫細胞功能紊亂有關(guān)。機體免疫失衡，產(chǎn)生自身血小板抗體，自身抗體致敏的血小板被單核巨噬細胞系統(tǒng)過度吞噬破壞，以及免疫失衡導(dǎo)致骨髓巨核細胞產(chǎn)血小板障礙，是ITP發(fā)病的主要機制［4］。近年來研究顯示機體免疫耐受被打破，自身反應(yīng)性T、B細胞異常激活(即細胞免疫異常)也參與了ITP的發(fā)生。CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，CD4+CD)是一種具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能抑制T、B細胞的活化、增殖及自身抗體的產(chǎn)生，維持機體免疫耐受，阻止自身免疫性疾病的發(fā)生［5］。許多研究表明ITP患者CD4+CD細胞表達下降，在ITP免疫學(xué)發(fā)病機制中起著重要作用［6-8］。我們通過流式細胞儀檢測ITP患者涼血解毒方藥治療前和治療后CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平變化情況，初步探討涼血解毒方藥治療ITP對CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3月至2013年3月河北省石家莊平安醫(yī)院血液科門診及住院患者56例為治療組，其中男12例，女44例;年齡18～62歲，中位年齡29歲;病程0.5～60個月，中位病程21個月;新診ITP患者5例，持續(xù)ITP患者11例，慢性ITP患者15例，重癥ITP患者23例，難治ITP 2例;其中初治患者5例，復(fù)治患者51例［均有糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑應(yīng)用史，停藥或減量后復(fù)發(fā)，來診時血小板值(13.04±11.2)×109/L］。ITP診斷及分型標準按照文獻［1］診斷:(1)至少2次實驗室檢查血小板計數(shù)減少，血細胞形態(tài)無異常;(2)脾臟一般不增大;(3)骨髓檢查巨核細胞數(shù)量增多或正常、有成熟障礙;(4)排除其他繼發(fā)性血小板減少癥，如自身免疫性疾病、甲狀腺疾病、藥物誘導(dǎo)的血小板減少、同種免疫性血小板減少、淋巴系統(tǒng)增殖性疾病、骨髓增生異常［再生障礙性貧血(AA)和骨髓增生異常綜合征(MDS)］、惡性血液病、慢性肝病脾功能亢進、血小板消耗性減少、妊娠血小板減少、感染等所致的繼發(fā)性血小板減少、假性血小板減少以及先天性血小板減少等。本研究獲得河北省石家莊平安醫(yī)院倫理委員會批準。選擇20例健康體檢者為對照組，其中男12例，女8例;年齡22～55歲，中位年齡32歲;均無自身免疫異常性疾病和腫瘤性疾病。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:凡符合ITP診斷標準［1］，年齡14歲以上，于2012年3月至2013年3月在石家莊平安醫(yī)院就診并簽署知情同意書的患者。

1.2.2 排除標準:有下列條件之一者不能入選本研究:有嚴重內(nèi)臟出血者;有顯著心理障礙者;嚴重肝功能障礙者;嚴重腎功能障礙者;不能服用中藥者;拒絕簽署知情同意書者。

1.3 剔除與脫落病例標準 (1)未按規(guī)定治療，無法判斷療效者;(2)資料嚴重不全影響療效或安全性判斷者;(3)治療過程中發(fā)生意外事件而不能堅持治療者;(4)治療過程中不配合治療者;(5)在觀察期內(nèi)失訪的患者。

1.4 方法

1.4.1 治療方法:入選病例給以涼血解毒方藥治療，地黃止血膠囊(河北省石家莊平安醫(yī)院，冀藥制字Z20050758，藥物組成:生地、茜草、丹皮、水牛角、太子參、三七等制成0.4 g/粒的膠囊)2 g，3次/d，并配合應(yīng)用自擬方“升板湯”，方藥組成:紫珠、炒梔子、鹿茸草、紫草、地錦草、連翹、卷柏、山藥，1劑/d，每劑水煎煮2次，共取藥汁300 ml左右，分早晚2次溫服。治療觀察3個月。有明顯出血者輔以氨甲環(huán)酸、酚磺乙胺等止血藥物，PLT＜10×109/L和并伴活動性出血的患者，給予人血丙種球蛋白輸注。

1.4.2 標本采集:ITP患者治療前1 d和治療第90天于清晨空腹采集外周靜脈血2 ml(EDTA抗凝)。20例健康成人外周血標本由我院體檢中心同法采集。

1.4.3 儀器與主要試劑:所用流式細胞儀為 BD FACSCanto II型，分析軟件為Cell Quest，均為美國BD公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗人IgG單抗、FITC標記的鼠抗人CD4單抗、藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人CD25單抗及溶血素均購自美國BD公司，pH值7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)由本實驗室配置。

1.4.4 CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平檢測:取抗凝全血5μl，分別加入5μl FITC標記的CD4抗體、PE標記的CD25抗體，室溫避光孵育15 min，加入溶血劑500μl，混勻后室溫避光孵育15 min，380×g離心5 min，棄上清，加入PBS 2 ml洗滌后，380×g離心5 min棄上清，加入PBS 500 ml懸浮細胞，上機檢測。數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件進行分析。

1.4.5 療效判定:①完全緩解(CR):PLT≥100×109/L且無出血;②有效:PLT≥30×109/L或較基線水平增長＞2倍且無出血;③無效:PLT＜30×109/L者較基線水平上升＜2倍或有出血。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者與正常對照組CD+4CD調(diào)節(jié)性T細胞水平比較 治療組治療前外周血CD4+C細胞水平［(1.01±0.67)%］低于正常對照組［(2.81±0.52)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。2.2 ITP患者治療前后外周血CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平比較 治療第90天患者CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平［(1.93±0.53)%］高于治療前［(1.01±0.67)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 ITP患者治療后CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水與對照組比較 治療第90天CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平仍低于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 流式細胞術(shù)檢測ITP患者涼血解毒方藥治療前后CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平%，±s

表1 流式細胞術(shù)檢測ITP患者涼血解毒方藥治療前后CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與治療前比較，#P ＜O.05

組別 治療前 治療后治療組(n=56) 1.01±0.67* 1.93±0.53*#對照組(n=20)2.81±0.52 -

表2 3組CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平%，±s

表2 3組CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平%，±s

注:與無效組比較，*P＜0.05

細胞有效組(n=41) 2.38±0.61組別 CD+4 CD+25調(diào)節(jié)性T*無效組(n=15) 1.51±0.73對照組(n=20) 2.81±0.52*

2.5 重癥ITP與非重癥ITP患者CD+4CD調(diào)節(jié)性T細胞水平比較 重癥ITP患者CD+4CD調(diào)節(jié)性T細胞水平低于非重癥患者(P＜0.01)。見表3。

表3 重癥ITP與非重癥ITP患者CD+4 CD調(diào)節(jié)性T細胞水平

表3 重癥ITP與非重癥ITP患者CD+4 CD調(diào)節(jié)性T細胞水平

注:與非重癥組比較，*P＜0.01

%，±s細胞重癥ITP(n=23) 0.71±0.23組別 CD+4 CD+25調(diào)節(jié)性T*非重癥ITP(n=33)1.48±0.64

3 討論

ITP發(fā)病機制目前尚未完全明確。近年來研究提示，T細胞異?？赡芷鹬鲗?dǎo)作用，異?；罨腡細胞，一方面抑制骨髓巨核細胞血小板的產(chǎn)生，一方面激活B細胞產(chǎn)生針對血小板的自生抗體［4，9］。而T細胞的活化受CD4+CDT細胞的調(diào)節(jié)，其數(shù)量減少、免疫抑制功能的減弱、抑制性細胞因子(IL-10、TGF-B等)分泌減少，減弱了其對T輔助細胞(Th cell)的抑制功能，T、B細胞異常活化，產(chǎn)生針對血小板表面糖蛋白的自身抗體，使血小板的破壞加速，并抑制巨核細胞的產(chǎn)板功能，從而導(dǎo)致ITP的發(fā)生。因此，CD+4CD調(diào)節(jié)性T細胞異常與 ITP 發(fā)病密切相關(guān)［10，11］。

我們采用流式細胞技術(shù)對56例ITP患者及20例正常對照者外周血CD4+CDT細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)ITP患者CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯低于對照組，應(yīng)用涼血解毒方藥治療后其CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞比例上升，明顯高于治療前，與我們以往研究［12］基本一致。國內(nèi)蔣磊等［13］選取35例成人急性自身免疫性血小板減少性紫癜患者作為試驗組，20例健康正常人為對照組，采用流式細胞技術(shù)檢測試驗組和對照組的外周血中CD4+CD調(diào)節(jié)T細胞表達率，結(jié)果試驗組明顯低于正常對照組，并且試驗組和對照組外周血中CD4+CD調(diào)節(jié)T細胞表達率與血小板計數(shù)呈正相關(guān)，換言之，ITP患者CD4+CD調(diào)節(jié)T細胞表達率越低其血小板計數(shù)也越低。張藍方等［14］檢測了41例ITP患者和41例健康查體者的CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平，結(jié)果ITP病例組外周血CD4+CD調(diào)節(jié)T細胞的百分率明顯低于正常對照組，治療后CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平上升。李振宇等［15］報道新診斷ITP患者的調(diào)節(jié)性T細胞水平明顯低于正常對照，治療后上升。我們的研究結(jié)果基本與上述研究報道一致。這些研究結(jié)果提示CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平降低參與了ITP的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸。另外，我們此次研究發(fā)現(xiàn)重癥ITP患者CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平明顯低于重癥患者，說明CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平與疾病嚴重程度相關(guān)，提示重癥患者免疫功能狀態(tài)紊亂程度更加嚴重。本組ITP患者應(yīng)用涼血解毒方藥治療總有效率73.2%(41/56)，治療后有效組CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平高于無效組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明患者隨著CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平的恢復(fù)血小板數(shù)量也增加，疾病趨于恢復(fù)。提示CD4+CD細胞在ITP發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用，涼血解毒方藥治療對ITP患者CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平有調(diào)節(jié)作用，有助于部分ITP患者CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平恢復(fù)正常水平，促進疾病的恢復(fù)。一部分患者應(yīng)用涼血解毒方藥治療無效，且其CDCD細胞水平也無恢復(fù)，提示ITP免疫紊亂機制的復(fù)雜性。

國內(nèi)研究者通過體外實驗探討了部分涼血解毒、涼血止血中藥對免疫功能的影響。沈紅等［16］研究提示清熱解毒中藥連翹的主要活性提取物連翹酯苷可通過影響小淋巴細胞增殖和細胞因子分泌而調(diào)節(jié)免疫細胞功能;王建杰等［17］研究發(fā)現(xiàn)涼血中藥丹皮的活性成分丹皮酚通過調(diào)節(jié) T細胞亞群比例，修復(fù)CD4+/CD8+比值，改善了 EMT6乳腺癌小鼠的免疫功能;敖亮等［18］發(fā)現(xiàn)清熱涼血中藥生地的水提取物對小鼠的體液免疫和和細胞免疫功能均有調(diào)節(jié)作用;米克熱帕·阿布都買買提等［19］研究顯示清熱涼血中藥紫草水提部位能顯著增加免疫低下小鼠的CD3+、CD4+T淋巴細胞的百分含量，增高CD4+/CD8+比值，降低CD8+T淋巴細胞的百分含量;綜合近期對涼血止血藥在對機體免疫功能影響的文獻顯示，三七具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能，既可以通過提高免疫T細胞活性來發(fā)揮免疫增強作用，又可以通過抑制一些炎性細胞因子如IL-6、IL-4等的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用［20-23］。這些現(xiàn)代藥理學(xué)研究的體外實驗揭示涼血解毒、涼血止血中藥具有調(diào)節(jié)機體T細胞免疫功能的作用。

本研究證實臨床應(yīng)用涼血解毒方藥治療ITP有效，其療效機制可能與調(diào)節(jié)機體免疫，特別是促進CD4+CD調(diào)節(jié)性T細胞水平恢復(fù)正常有關(guān)，可作為中醫(yī)治療ITP的推薦治療方案。

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