楊彥忠　崔澂　馬有祥　唐堅(jiān)　段乃超　任秀敏

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科(楊彥忠、段乃超、任秀敏) ;中國(guó)人民解放軍白求恩醫(yī)務(wù)士官學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系(崔澂、唐堅(jiān)) ;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(馬有祥)

青蒿琥酯下調(diào)人喉癌細(xì)胞所致T細(xì)胞免疫抑制的體外實(shí)驗(yàn)研究

楊彥忠崔澂馬有祥唐堅(jiān)段乃超任秀敏

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科(楊彥忠、段乃超、任秀敏) ;中國(guó)人民解放軍白求恩醫(yī)務(wù)士官學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系(崔澂、唐堅(jiān)) ;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(馬有祥)

【摘要】目的體外實(shí)驗(yàn)研究青蒿琥酯(ART)對(duì)人喉癌細(xì)胞所致T細(xì)胞免疫抑制的影響。方法制備經(jīng)ART預(yù)處理的人喉癌Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清(ART-S)，收集連續(xù)2次再培養(yǎng)的上清(分別稱為ART-S1、ART-S2)，以不經(jīng)ART作用的Hep-2及其上清作對(duì)照;分析對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)光鏡觀察、噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定的植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖反應(yīng)，以及流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FCM)法檢測(cè)的T淋巴細(xì)胞表面CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+表達(dá)的影響。結(jié)果Hep-2對(duì)5項(xiàng)免疫指標(biāo)的抑制率分別為(52.58±6.13) %、(50.34±7.26) %、(45.28±5.38) %、(39.74±5.27) %、(64.25±9.37) %。ART作用后，可顯著下調(diào)Hep-2所致T細(xì)胞免疫抑制(P＜0.01) ;第1次再培養(yǎng)后，對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)增殖、IL-2Rα表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)均明顯降低，與ART-S比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對(duì)CD3ε+及CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)持續(xù)增強(qiáng)，與ART-S比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;第2次再培養(yǎng)后，對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)增殖、IL-2Rα表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)繼續(xù)保持，與ART-S1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，對(duì)CD3ε+、CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)明顯下降回復(fù)至ART-S水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論人喉癌Hep-2細(xì)胞可產(chǎn)生T細(xì)胞免疫抑制作用，ART可對(duì)其產(chǎn)生穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)作用。下調(diào)腫瘤免疫抑制是ART的重要抗瘤機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】青蒿琥酯;喉癌; Hep-2細(xì)胞; T淋巴細(xì)胞;免疫抑制;逆轉(zhuǎn)

E-mail: cuicheng7777@ sina.com

喉癌是喉部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)［1］。傳統(tǒng)手術(shù)及放化療多加重惡性腫瘤所致免疫抑制，使其很難與各種免疫增強(qiáng)治療協(xié)同發(fā)揮理想療效［2，3］。因此，急需尋找具有免疫抑制逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，且不對(duì)機(jī)體免疫功能造成進(jìn)一步損傷的新型多靶點(diǎn)抗瘤藥物。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究青蒿琥酯(artesunate，ART)對(duì)人喉癌細(xì)胞所致T細(xì)胞免疫抑制的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證其新型抗瘤機(jī)制，為拓寬其臨床應(yīng)用、解決喉癌治療中的難題提供新思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人喉癌Hep-2細(xì)胞，為中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院科研中心徐錚教授惠贈(zèng)。外周血取自健康成年志愿者20名，男女各半，年齡27～32歲，平均年齡(29.6±2.5)歲。所有志愿者均已知情同意。

1.2主要試劑及儀器DMEM為北京?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司產(chǎn)品，每升完全培養(yǎng)液(complete medium，CM)中含胎牛血清0.1 L、青霉素100 000 U、鏈霉素100 mg;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司產(chǎn)品;青霉素及鏈霉素為華北制藥集團(tuán)產(chǎn)品。胰蛋白酶、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、噻唑藍(lán)［3-(45-dimethy1-2-thiazolyl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium，MTT］均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;以0.01 mol/L pH值7.4的PBS將MTT配制成5 g/L。淋巴細(xì)胞分離液為上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品［密度(1.077±0.002) g/ml］。注射用ART粉劑為桂林南藥股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H10930195，60 mg/瓶，以1 ml 5% NaHCO3溶解，實(shí)驗(yàn)前用CM稀釋至所需濃度。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的小鼠抗人CD3ε單抗(CD3-FITC)及CD4單抗(CD4-PE)、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標(biāo)記的小鼠抗人CD25 (IL-2Rα)單抗(CD25-PE)及CD247(CD3ζ鏈)單抗(CD247-PE)均為美國(guó)eBioscience公司產(chǎn)品。MK353型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為芬蘭Thermolabsystems公司產(chǎn)品，EPICS-XL4型流式細(xì)胞檢測(cè)儀為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)用ART濃度的確定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，再分別加入系列稀釋的不同濃度ART (100 μl/孔)，使細(xì)胞終濃度為2× 108/L，ART的終濃度分別為200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.50 mg/L、6.25 mg/L、3.125 mg/L;設(shè)立培養(yǎng)液空白對(duì)照孔，單純Hep-2細(xì)胞對(duì)照孔(Control) ;一式三份，混勻后置37℃5% CO2飽和濕度中孵育24 h，MTT法檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)的A 值(A492)，選擇對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖無(wú)影響的ART最高濃度作為實(shí)驗(yàn)用濃度。

1.4ART作用及作用后再培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞及培養(yǎng)上清的制備收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，分別用不含和含選定濃度ART的CM重懸至2×108/L，37℃5% CO2飽和濕度中培養(yǎng)24 h，離心收集未經(jīng)ART作用同步培養(yǎng)的相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞(control-C)及上清(control-S)，以及經(jīng)ART作用后的細(xì)胞(ART-C)及上清(ART-S)。細(xì)胞經(jīng)徹底清洗去除殘余藥物后，重懸至初始接種濃度再培養(yǎng)，收集連續(xù)2次再培養(yǎng)的細(xì)胞及上清(分別稱為ART-C1、ART-S1 及ART-C2、ART-S2)，以不經(jīng)ART作用的相應(yīng)同步再培養(yǎng)細(xì)胞及上清作為對(duì)照(分別稱為control-C1、control-S1及control-C2、control-S2)。培養(yǎng)的細(xì)胞均以臺(tái)盼蘭染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的A492值;收集的上清－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PBMC生長(zhǎng)增殖的影響

常規(guī)制備健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells，PBMC)懸液(5×109/L)加入96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，再分別加入Hep-2腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μl/孔;設(shè)立不含腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的PBMC對(duì)照孔(control)和培養(yǎng)液空白對(duì)照孔;均設(shè)3復(fù)孔?；靹蚝笾?7℃5% CO2飽和濕度中培養(yǎng)72 h，MTT法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6各種培養(yǎng)上清對(duì)人PBMC T淋巴細(xì)胞免疫功能指標(biāo)的影響

1.6.1對(duì)植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響:常規(guī)制備健康志愿者PBMC懸液(1×1010/L)加入96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)孔每孔加入PBMC、PHA (20 mg/L)各50 μl及待測(cè)上清100 μl;設(shè)立以CM代替待測(cè)上清的PHA誘導(dǎo)增殖正常對(duì)照孔(control)、單純PBMC對(duì)照孔及培養(yǎng)液空白對(duì)照孔;均設(shè)三復(fù)孔，混勻后37℃5% CO2飽和濕度中培養(yǎng)72 h。取沉淀細(xì)胞涂片，自然干燥后以95%乙醇固定15 min，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=(轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)/200)×100%;同時(shí)，以MTT法檢測(cè)誘導(dǎo)增殖的A492值，按下式計(jì)算淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增殖抑制率(%)=［(control組A492值－實(shí)驗(yàn)組A492值)/control組A492值］×100%。

1.6.2對(duì)T淋巴細(xì)胞表面活化信號(hào)分子表達(dá)的影響:常規(guī)制備健康志愿者PBMC懸液(1×1010/L)，在5 ml培養(yǎng)瓶中加入PBMC、PHA(20 mg/L)各0.25 ml及待測(cè)上清0.5 ml;設(shè)立以CM代替待測(cè)上清的正常對(duì)照(control)。37℃5% CO2飽和濕度中培養(yǎng)48 h，取1× 106個(gè)細(xì)胞，分別加入CD4-FITC及CD25-PE或CD3-FITC及CD247-PE單抗各20 μl，室溫避光孵育20 min。離心棄上清，0.5 ml PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+細(xì)胞表達(dá)百分率，分別計(jì)算表達(dá)抑制率(%)=［(control組陽(yáng)性細(xì)胞百分率－實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞百分率)/control組陽(yáng)性細(xì)胞百分率］×100%。每次均設(shè)定淋巴細(xì)胞門(mén)，并用相同熒光素標(biāo)記的人Isotype IgG作為陰性對(duì)照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，q檢驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)用ART濃度的確定與無(wú)ART作用的對(duì)照組比較，ART作用于初始接種終濃度為2×108/L的Hep-2細(xì)胞24 h后，MTT法檢測(cè)A492值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)的最高濃度為6.25 mg/L，即對(duì)Hep-2腫瘤細(xì)胞無(wú)直接毒性的ART最高濃度，確定為實(shí)驗(yàn)用濃度。經(jīng)確定濃度的ART作用24 h及作用后連續(xù)兩次再培養(yǎng)的Hep-2腫瘤細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法檢測(cè)的A492值與未經(jīng)ART作用同步培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明6.25 mg/L的ART作用于Hep-2細(xì)胞24 h后未影響其細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性。見(jiàn)圖1，表1。

圖1　系列濃度的ART對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

表1　ART作用后對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響　±s

表1　ART作用后對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響　±s

組別　細(xì)胞數(shù)(×108/L) (n=3)　A492(n=10) control-C　4.35±0.10　1.22±0.08 control-C1　4.27±0.08　1.20±0.10 control-C2　4.17±0.25　1.18±0.12 ART-C　4.22±0.09　1.21±0.09 ART-C1　4.29±0.04　1.17±0.11 ART-C2　4.28±0.17　1.16±0.15 F值2.712　0.3951 P值0.097　0.843

2.2Hep-2腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PBMC增殖的影響

ART腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與PBMC共培養(yǎng)后，所檢測(cè)的A492值與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)腫瘤免疫抑制檢測(cè)指示細(xì)胞PBMC無(wú)直接毒性作用。見(jiàn)表2。

2.3Hep-2腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞免疫功能的影響在以培液代替Hep-2培養(yǎng)上清進(jìn)行正常免疫功能指標(biāo)檢測(cè)的正常對(duì)照組(control)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增殖的A492值、CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+

表2　Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PBMC生長(zhǎng)增殖的影響n=5，±s

表2　Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PBMC生長(zhǎng)增殖的影響n=5，±s

組別A492 control-C　0.31±0.05 control-C1　0.29±0.07 control-C2　0.32±0.06 control　0.28±0.05

細(xì)胞百分率分別為(82.34±5.68) %、(0.94±0.05)、(86.07±10.05) %、(25.09±5.84) %、(39.11± 5.83) %。單純腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(control-S1)可使5項(xiàng)免疫功能指標(biāo)明顯受抑，分別為(42.06±7.34) %、0.49±0.08、(49.03±7.10) %、(15.75±4.33) %、(14.99±3.21) % (P＜0.01)，抑制率分別為(52.58 ±6.13) %、(50.34±7.26) %、(45.28±5.38) %、(39.74±5.27) %、(64.25±9.37) %。

2.4ART對(duì)Hep-2所致T細(xì)胞免疫抑制的影響

2.4.1對(duì)PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖抑制的影響: ART直接作用后，可顯著下調(diào)Hep-2腫瘤細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化及增殖抑制［ART-S與control-S比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)］;其第1次再培養(yǎng)上清(ART-S1)對(duì)免疫功能抑制的逆轉(zhuǎn)作用均明顯降低［與ART-S、control-S1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］;此種免疫抑制逆轉(zhuǎn)作用在其第2次再培養(yǎng)上清(ART-S2)中可繼續(xù)保持［與ART-S1比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)］;與control-S2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］。見(jiàn)表3、4。

2.4.2T淋巴細(xì)胞表面活化信號(hào)分子表達(dá)抑制的影響: ART直接作用后，可顯著下調(diào)Hep-2腫瘤細(xì)胞所致的CD3ε+、CD3ε+ζ+、IL-2Rα+表達(dá)抑制［ART-S 與control-S比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］;其第1次再培養(yǎng)上清(ART-S1)對(duì)IL-2Rα+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)作用明顯降低［與ART-S比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;與control-S1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］，對(duì)CD3ε+及CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)作用持續(xù)增強(qiáng)［與ART-S比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)］;與control-S1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］;其第2次再培養(yǎng)上清(ART-S2)，對(duì)IL-2Rα表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)作用繼續(xù)保持［與ART-S1比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)］;與control-S2比較，P＜0.01)，對(duì)CD3ε+及CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)作用明顯下降［與ART-S1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;與control-S1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)］回復(fù)至ART-S水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3、4。

3　討論

受空氣污染、生活工作壓力等因素影響，近年來(lái)喉癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。目前，臨床常規(guī)采用手術(shù)結(jié)合放化療方案，但綜合療效不甚理想。其中，喉癌細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制是制約綜合療效充分發(fā)揮的瓶頸性難題，尤為突出和關(guān)鍵的是腫瘤細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞免疫抑制［4－6］。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步揭示了新型抗瘤中藥制劑ART對(duì)喉癌T細(xì)胞免疫抑制的下調(diào)作用。

實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計(jì)中考慮到ART在超過(guò)一定濃度范圍后，可影響待測(cè)免疫指標(biāo)中指示細(xì)胞的增殖存活狀態(tài)及功能，因此，我們?cè)谄渥饔煤戆〩ep-2細(xì)胞后，徹底洗去殘存的中藥制劑，取再培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞及其上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且不經(jīng)藥物作用的單純Hep-2培養(yǎng)上清對(duì)免疫指示細(xì)胞PBMC的生長(zhǎng)增殖亦無(wú)影響，確保能真實(shí)反映ART對(duì)Hep-2腫瘤細(xì)胞所致T細(xì)胞免疫抑制的影響，而非ART及腫瘤細(xì)胞上清對(duì)免疫指示細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的直接影響。同時(shí)，腫瘤免疫抑制是腫瘤細(xì)胞分泌并存在于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的免疫抑制物質(zhì)所直接引發(fā)的結(jié)果，而腫瘤細(xì)胞的分泌功能又直接取決于其自身增殖活性，因此，我們所使用的ART濃度不能影響Hep-2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。結(jié)果顯示，2×108/L Hep-2細(xì)胞經(jīng)6.25 mg/L ART作用24 h，及作用后洗去殘留藥物再行連續(xù)兩次24 h傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，其活細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法檢測(cè)A492值與未經(jīng)藥物作用同步對(duì)照培養(yǎng)的Hep-2之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和各種實(shí)驗(yàn)條件確定表明，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確能真實(shí)反映ART對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞免疫抑制的影響，而非藥物改變腫瘤細(xì)胞和免疫檢測(cè)指示細(xì)胞的增殖存活狀態(tài)所致。

PHA是T淋巴細(xì)胞多克隆激活劑，凡有功能活性的人T淋巴細(xì)胞均可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化增殖; IL-2Rα是T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志，其表達(dá)率可反映T淋巴細(xì)胞活化水平; CD3ε和ζ鏈?zhǔn)荰淋巴細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要膜分子，CD3ε+ζ+表達(dá)率可反映T淋巴細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。因此，本研究選用人PBMC的PHA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化增殖、細(xì)胞表面IL-2Rα和CD3ε+ζ+表達(dá)，可較好地反映T淋巴細(xì)胞的免疫功能［7］。結(jié)果顯示，人喉癌Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清可穩(wěn)定地顯著抑制所測(cè)PBCM 的5項(xiàng)免疫功能指標(biāo)，對(duì)T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增殖以及CD3ε鏈、ζ鏈、IL-2Rα等T淋巴細(xì)胞活化信號(hào)表達(dá)的抑制率可達(dá)50%左右。ART作用后，均可使Hep-2細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞免疫抑制發(fā)生一定程度的逆轉(zhuǎn)。其中，對(duì)CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)可使其暫時(shí)完全恢復(fù)至正常對(duì)照組水平;淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)增殖抑制以及IL-2Rα+表達(dá)抑制的下調(diào)程度及維持時(shí)間相近，CD3ε+、CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的下調(diào)程度及維持時(shí)間相近。上述結(jié)果提示，ART可有效下調(diào)人喉癌細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的抑制，從而使T淋巴細(xì)胞部分恢復(fù)其正?？沽龌钚裕糠窒[瘤細(xì)胞免疫抑制。其中，人喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞IL-2Rα+表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，ART對(duì)其表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)強(qiáng)度相對(duì)較弱、對(duì)CD3ε+ζ+表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)作用較強(qiáng)。因此，下調(diào)腫瘤免疫抑制是ART的重要抗瘤作用機(jī)制之一。

表3　ART作用后的Hep-2細(xì)胞對(duì)健康成人外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響n=10，±s

表3　ART作用后的Hep-2細(xì)胞對(duì)健康成人外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響n=10，±s

注:與control比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與control-S、control-S1、control-S2比較，△P＜0.05，☆P＜0.01;與ART-S比較，▲P＜0.05;與ART-S1比較，★P＜0.05

組別　轉(zhuǎn)化率(%)　誘導(dǎo)增殖(A492)　CD3 ε+(%) CD3ε+ζ+(%) IL-2R α+(%) control　82.34±5.68　0.94±0.05　86.07±10.05　25.09±5.84　39.11±5.83 control-S　40.11±6.07#　0.47±0.12#　45.34±8.42#　13.24±3.79#　15.47±4.34#control-S1　42.06±7.34#　0.49±0.08#　49.03±7.10#　12.75±2.33#　14.99±3.21#control-S2　39.08±6.96#　0.43±0.09#　43.96±6.23#　12.58±3.26#　13.47±5.07#ART-S　74.79±4.26＊☆　0.79±0.12#☆　63.05±5.29＊☆　20.20±2.01＊☆　29.37±2.52＊☆A(yù)RT-S1　57.29±3.87☆▲　0.59±0.10#△▲　71.36±3.04＊△▲　23.45±1.57☆▲　21.89±4.35#☆▲ART-S2　60.12±4.36☆▲　0.62±0.09#△▲　65.29±5.34＊☆★　19.59±3.04＊☆★　21.76±2.45#☆▲

表4　ART對(duì)Hep-2細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞免疫抑制的下調(diào)影響　n=10，±s

表4　ART對(duì)Hep-2細(xì)胞所致T淋巴細(xì)胞免疫抑制的下調(diào)影響　n=10，±s

注:與control-S、control-S1、control-S2比較，*P＜0.01;與ART-S比較，#P＜0.05;△P＜0.01;與ART-S1比較，☆P＜0.05

組別　轉(zhuǎn)化率(%)　誘導(dǎo)增殖(A492)　CD3ε+(%)　CD3ε+ζ+(%)　IL-2Rα+(%) control-S　51.31±8.07　51.26±3.65　47.12±7.9242.23±8.14　60.24±7.54 control-S1　52.58±6.13　50.34±7.26　45.28±5.38　39.74±5.27　64.25±9.37 control-S2　50.96±8.62　53.89±5.21　49.67±7.12　45.46±9.03　63.17±8.22 ART-S　10.06±3.67*　16.20±4.25*　25.74±6.08*　20.03±5.34*　25.69±6.37*ART-S1　30.34±5.27＊△　38.23±5.09＊△　16.93±6.41* #　6.73±0.54* #　44.13±7.26* #ART-S2　26.12±6.23＊△　35.99±6.11＊△　23.45±5.43＊☆　21.10±3.34＊☆　43.39±8.11*#

ART是青蒿素的單體衍生物，是我國(guó)科學(xué)工作者自主研發(fā)的抗瘧藥［8］，其抗瘤活性是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。與已證實(shí)有抑瘤效果的中藥制劑相比，ART注射液制劑使用方便、起效較快、作用較強(qiáng)、臨床應(yīng)用價(jià)值較高，且對(duì)化療藥物的交叉耐藥作用小，可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化、影響腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖［9－12］。本研究結(jié)果顯示，ART還可同時(shí)發(fā)揮下調(diào)腫瘤免疫抑制的作用。因此，ART在抗瘤效應(yīng)發(fā)揮過(guò)程中，具多靶點(diǎn)作用、安全高效、價(jià)廉無(wú)毒、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢(shì)，既可正向殺傷抑制腫瘤細(xì)胞、提高機(jī)體抗瘤免疫功能，又可反向逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制，可從不同角度的機(jī)制途徑發(fā)揮多靶點(diǎn)抗瘤功效。

目前，惡性腫瘤的治療手段已由單一的手術(shù)治療加放化療逐步向以手術(shù)治療為核心的個(gè)體化綜合治療模式轉(zhuǎn)變，而個(gè)體化的針對(duì)性主要集中體現(xiàn)在由于患病機(jī)體抗瘤免疫功能的個(gè)體化差異所導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)增殖狀況及預(yù)后的不同，其中腫瘤免疫抑制狀況是影響綜合治療效果的關(guān)鍵。因此，本研究通過(guò)靶向腫瘤免疫抑制逆轉(zhuǎn)作用研究，扭轉(zhuǎn)輸注免疫效應(yīng)細(xì)胞或分子提高患病機(jī)體抗瘤免疫的被動(dòng)劣勢(shì)，以主動(dòng)直接地矯正抗瘤能力，使機(jī)體擺脫腫瘤免疫逃逸，應(yīng)能達(dá)到增強(qiáng)臨床治療效果、提高生存率的目的。同時(shí)，這還將為尋找腫瘤免疫抑制逆轉(zhuǎn)類抗瘤藥劑、深入挖掘ART的抗瘤潛力和新機(jī)制提供理論依據(jù)。

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Down-regulating effect of Artesunate on T lymphocytes’immunosuppression in human laryngocarcinoma cells in vitro

YANG Yanzhong*，CUI Cheng，MA Youxiang，et al.*
Department of Otorhinolaryngology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Artesunate (ART) on T lymphocytes’immunosuppression in human laryngocarcinoma cells in vitro.MethodsThe supernatants from Hep-2 (human laryngocarcinoma cell line) were pretreated with ART (ART-S)，then the supernatants cultured for the first time and the second time were collected (ART-S1 and ART-S2，respectively)，and the corresponding supernatants and Hep-2 without ART treatment were served as control group.The effects of different supernatants on immune parameters in human peripheral blood mononuclear cells were analyzed，including the lymphocytes proliferation induced by phytohemagglutinin (PHA)，which was detected by MTT and microscope observation，and expressions of CD3ε+，CD3ε+ζ+and IL-2Rα+were measured by flow cytometry (FCM).Results The inhibitory rates of five immune parameters caused by Hep-2 cells were 52.58%±6.13%，50.34%±7.26%，45.28%± 5.38%，39.74%±5.27%，64.25%±9.37%，respectively.After pretreated with ART，the inhibition effects caused by Hep-2 were significantly decreased (P＜0.01).After the first culture，the reversing effect on the inhibition of lymphocytes transformation，induced proliferation and the expression of IL-2Rα+were significantly decreased in ART-S1 group，as compared with those in ART-S group (P＜0.01)，and the reversing effects on the inhibition of CD3ε+and CD3ε+ζ+expressions were obviously kept，as compared with those in ART-S group (P＜0.05).After the second culture，there were no significant differences in，reversing effects on the inhibition of lymphocytes transformation，induced proliferation and the expression of IL-2Rα+between ART-S2 group and ART-S1 group (P＞0.05)，nor were the reversing effects on the inhibition of CD3ε+and CD3ε+ζ+expressions between ART-S2 group and ART-S1 group (P＞0.05).Conclusion

Human laryngocarcinoma Hep-2 cells have T lymphocytes immunosuppression effects.However Artesunate can steadily reverse the immunosuppression effects.Down-regulating tumor immunosuppression effect may be one of important anti-tumor action mechanisms of Artesunate.

【Key words】Artesunate; laryngocarcinoma; Hep-2; T lymphocytes; immunosuppression; reversion

(收稿日期:2014－07－20)

通訊作者:崔澂，050081石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩醫(yī)務(wù)士官學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.07.003

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 07－0972－05

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 285.5