周青松，靳風(fēng)爍，李彥鋒，張 軍，張克勤，孫中義

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

·基礎(chǔ)研究·

真核表達質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b雄鼠免疫避孕效應(yīng)研究

周青松，靳風(fēng)爍，李彥鋒，張 軍，張克勤，孫中義

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

目的 研究小鼠Bin1b真核表達重組質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b的DNA疫苗雄鼠免疫避孕效應(yīng)。方法 應(yīng)用pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b(C3d3-Bin1b組)肌注免疫雄鼠，觀察其精子活力及避孕效應(yīng)，ELISA法檢測雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗體最大稀釋度、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平。PBS組、空載體pSG.SS.YL組(空載體組)和pSG.SS.YL.Bin1b組(Bin1b組)為對照組。結(jié)果 C3d3-Bin1b組雄鼠精子活力、雌鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量顯著降低，免疫避孕效果顯著好于Bin1b組。C3d3-Bin1b組雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗體滴度顯著升高，血清IL-2、INF-γ濃度顯著降低，血清IL-4、IL-10濃度顯著增加。結(jié)論 真核表達重組質(zhì)粒pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b可有效誘導(dǎo)雄鼠產(chǎn)生免疫性避孕效應(yīng)，效果優(yōu)于pSG.SS.YL.Bin1b。

抗菌肽蛋白；避孕疫苗；C3d3

雄性免疫節(jié)育疫苗的開發(fā)可能成為控制人口過度增長的理想措施，而靶抗原的選擇及增強免疫效應(yīng)的有效途徑則是構(gòu)建該類疫苗的最關(guān)鍵部分。附睪對精子具有促進成熟、儲存和保護作用，目前認(rèn)為附睪是進行抗生育的一個理想的靶器官[1-2]，因為附睪功能較為單一，藥物不致引起嚴(yán)重的副作用，而且精子在進入附睪前已經(jīng)分化完全，不涉及DNA復(fù)制機能，干擾藥物不會引起DNA改變的遺傳病。目前認(rèn)為附睪頭部中段上皮細(xì)胞所分泌的抗菌肽蛋白(Bin1b)“啟動”了精子的前向運動，促進精子的成熟，進行這一功能的阻斷研究可能是雄性免疫節(jié)育的關(guān)鍵點[3-4]。研究表明，2～3個補體C3裂解片段(C3d)拷貝能顯著提高抗原免疫原性[5-6]。因此，本研究制備含有小鼠Bin1b和串聯(lián)3個C3d(C3d3)融合基因的真核重組表達質(zhì)粒pSG. SS.C3d3.YL.Bin1b，將該DNA疫苗接種于雄性昆明小鼠，觀察其免疫性避孕效應(yīng)。

1 材料與方法

1．1 質(zhì)粒、動物和儀器質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b為本課題組前期構(gòu)建。昆明小鼠雄性24只，雌性72只，均為8周齡以上有生育能力的健康成年鼠，每只小鼠體重為20～22 g。96孔酶標(biāo)板(丹麥NUNC)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國 Biorad)。

1．2 方法及檢測

1．2．1 小鼠免疫程序 隨機將24只雄性小鼠分為4組，pSG.SS.YL-Bin1b組(Bin1b組)、pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b組(C3d3-Bin1b組)、空載體pSG.SS.YL(空載體組)和 PBS陰性對照組(PBS組)，每組6只。C3d3-Bin1b組用質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b注射股四頭肌，輪流注射兩側(cè)肢體，初免及加強(0、2、4周)共3次，每次接種DNA量100 pmol/100 μL。等量無菌 0.01 mol/L PBS注射PBS組，用空載體pSG.SS.YL對空載體組進行免疫，Bin1b組用pSG.SS.YL-Bin1b進行免疫。

1．2．2 免疫避孕效應(yīng)觀察 把免疫后6周的各組雄鼠與同齡健康有生育力的雌鼠合籠喂養(yǎng)，雌雄鼠合籠比例為3∶1，若合籠雌鼠出現(xiàn)有陰道栓，則立即分籠喂養(yǎng)雌鼠，統(tǒng)計各組孕鼠數(shù)量及每窩產(chǎn)仔數(shù)量。

1．2．3 標(biāo)本采集 取各組小鼠初次免疫后2、4、8周斷尾血15 μL，混入 30 μL阿氏保存液，4℃靜置3 h，離心(1 000 r/min×5 min)后取上清液，在-70 ℃冰箱中保存，用于抗體檢測。首次免疫后第8周處死雄鼠，體表酒精消毒，解剖雄鼠，取出雙側(cè)附睪尾，放入生理鹽水中，清理表面血污及脂肪。將附睪尾置于培養(yǎng)皿液滴中央，切碎附睪采集精子，精子懸液立即進行顯微觀察與活力計數(shù)。

1．2．4 血清Bin1b抗體檢測 采用ELISA分析法檢測抗體濃度， A背景值為PBS組血清稀釋10倍所測值，超過A背景值3倍為陽性，抗體滴度為稀釋血清至非陽性范圍內(nèi)的終末稀釋值。

1．2．5 血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平測定 按ELISA試劑盒說明書操作(美國R&D公司)。

1．3 統(tǒng)計分析應(yīng)用軟件SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異非常顯著。

2 結(jié) 果

2．1 免疫性避孕效應(yīng)觀察與兩對照組相比，C3d3-Bin1b組和Bin1b組雌鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量均顯著降低，雄鼠精子活力顯著下降，C3d3-Bin1b組變化趨勢較Bin1b組顯著(見表1)。

組別雌鼠受孕率(%)每胎產(chǎn)仔數(shù)(只)雄鼠精子活力(%)PBS組10011.3±2.182.6±5.5空載體組10010.9±2.882.3±5.8Bin1b組 55.6*5.9±1.2*42.5±6.6*C3d3-Bin1b組 27.8△3.4±1.1△27.1±9.3△

與PBS組、空載體組比較，*P<0.01;與其他三組比較,△P<0.01

2．2 雄鼠血清抗Bin1b抗體生成情況測定Bin1b組和C3d3-Bin1b組首次接種后2、4、8周均出現(xiàn)抗體陽性反應(yīng)。Bin1b組最大稀釋度分別為1∶20、1∶80和1∶640，C3d3-Bin1b組最大稀釋度分別為1∶80、1∶320和1∶2 560，顯著高于同期Bin1b組。PBS組和空載體組均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。

2．3 雄鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平測定結(jié)果IL-2和INF-γ質(zhì)量濃度在Bin1b組和 C3d3-Bin1b組呈降低趨勢，并且C3d3-Bin1b組顯著低于Bin1b組，PBS組和空載體組無顯著區(qū)別。IL-4和IL-10濃度在Bin1b組和 C3d3-Bin1b組呈升高趨勢， Bin1b組顯著低于C3d3-Bin1b組(表2～表5)。

組別2周 4周 8周 PBS組37.7±3.636.6±3.436.9±2.9空載體組36.8±2.836.2±3.136.3±2.8Bin1b組31.5±2.8*28.4±3.2*25.2±3.5*C3d3-Bin1b組25.6±2.7△22.4±2.6△18.1±1.4△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組9.15±0.629.02±0.849.10±0.51空載體組9.12±0.389.08±0.698.92±0.95Bin1b組8.04±0.55*7.13±0.45*5.94±0.68*C3d3-Bin1b組5.81±0.39△4.95±0.47△4.56±0.34△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組49.2±5.148.8±4.148.5±5.0空載體組49.1±3.049.3±3.850.9±4.2Bin1b組58.4±4.2*63.2±7.1*68.2±4.3*C3d3-Bin1b組68.7±5.1△74.1±4.9△79.5±5.5△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組30.9±3.831.1±3.330.2±3.8空載體組30.8±3.531.5±2.228.9±3.9Bin1b組39.3±4.6*44.0±5.3*50.1±3.4*C3d3-Bin1b組47.3±5.2△51.9±6.5△56.8±5.6△

與PBS組、空載體組比較，*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

3 討 論

抗菌肽蛋白(Bin1b)為附睪頭部中段的上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白，它被分泌入管腔后，結(jié)合沒有運動能力的精子，使精子通過L型鈣離子通道攝取鈣離子，進一步促進了精子運動。前期研究也發(fā)現(xiàn)，將未成熟的附睪頭部精子和轉(zhuǎn)染Bin1b的小腸上皮細(xì)胞或附睪頭部上皮細(xì)胞(含Bin1b)共培養(yǎng)，精子運動加強，但在加入Bin1b抗體后，精子的運動能力無變化；此外，向成熟的附睪尾部精子中加入Bin1b抗體后，沒有改變精子的運動能力。說明Bin1b對成熟精子的運動不起作用，但是能促進未成熟精子的運動[7]。

本研究組在前期實驗中成功構(gòu)建了pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b重組真核表達質(zhì)粒，本實驗進一步研究了重組質(zhì)粒DNA疫苗雄鼠免疫避孕效應(yīng)，采用的方法是DNA疫苗注射。相比傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗具有高效、持久、簡便、廣譜、廉價、無致病性等突出的優(yōu)勢。

本研究結(jié)果表明，pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗免疫雄性小鼠后，精子活力、雌性小鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量顯著降低，其避孕效應(yīng)顯著優(yōu)于Bin1b組。雄鼠在未加強免疫時，血清中就已產(chǎn)生Bin1b特異性抗體，而且滴度逐漸升高。機體在抗原刺激后，會產(chǎn)生相應(yīng)的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，判斷免疫應(yīng)答類型的主要依據(jù)是抗原刺激機體后導(dǎo)致細(xì)胞因子微環(huán)境的改變。前期研究發(fā)現(xiàn)，C3d作用機制與以下因素有關(guān)：① 補體C3是補體激活途徑中的樞紐，并保持與抗原共價連接的能力[8]。②C3d通過與抗原耦聯(lián)，增加抗原分子量，提高低親和性/小分子量抗原的免疫原性[9]。③B細(xì)胞表面的CR2/ CD21和BCR分別與耦連的C3d和抗原結(jié)合，使BCR與 CD19交聯(lián)，從而直接將免疫效應(yīng)細(xì)胞與抗原相連，產(chǎn)生共刺激信號[10]。

精漿中含有IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、腫瘤壞死因子、干擾素等多種細(xì)胞因子, 它們對精子的發(fā)生和功能等發(fā)揮著直接和間接的生物學(xué)作用[11], 從而對男性生育產(chǎn)生影響。IL-2 和IL-4 均由活化的輔助性T 細(xì)胞(Th) 分泌, 其中Th1 分泌IL-2，Th2 分泌IL-4, 在正常情況下，Th1 和Th2 維持一定平衡, 在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖分化及功能調(diào)控方面起重要調(diào)節(jié)作用。IL-2最重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖(從G0期進入S期)和分化。其對T細(xì)胞的作用還包括增強細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞毒活性，增加細(xì)胞內(nèi)pH，誘導(dǎo)c-myc、c-myb和IL-2受體表達，促進細(xì)胞移動，增強細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子干擾素(IFN)-7、IL-4、TNF和集落刺激因子CSF等。本實驗中，對相關(guān)細(xì)胞因子檢測后發(fā)現(xiàn)，IL-2和INF-γ濃度在C3d3-Bin1b組呈降低趨勢，表明C3d3能顯著增強Bin1b疫苗免疫原性，抑制IL-2、IL-4和INF-γ的生物活性，進而抑制精子細(xì)胞活力。C3d對Bin1b具有顯著調(diào)節(jié)作用。相對與Bin1b組，IL-4和IL-10濃度在C3d3-Bin1b組呈升高趨勢， IL-2和INF-γ濃度在C3d3-Bin1b組呈降低趨勢，表明C3d3能顯著增強Bin1b疫苗免疫原性，誘導(dǎo)更強免疫反應(yīng)。

綜上所述，pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗可有效誘導(dǎo)雄鼠產(chǎn)生免疫性避孕效應(yīng)，效果顯著優(yōu)于pSG.SS.YL.Bin1b。

[1] PEROBELLI JE, ALVES TR, DE TOLEDO FC, et al. Impairment on sperm quality and fertility of adult rats after antiandrogen exposure during prepuberty [J]. Reprod Toxicol,2012,33(3):308-315.

[2] CHABORY E, DAMON C, LENOIR A, et al.Mammalian glutathione peroxidases control acquisition and maintenance of spermatozoa integrity [J]. J Anim Sci,2010,88(4): 1321-1331.

[3] CAO D, LI Y, YANG R, et al.Lipopolysaccharide-induced epididymitis disrupts epididymal beta-defensin expression and inhibits sperm motility in rats [J]. Biol Reprod,2010,83(6): 1064-1070.

[4] LI P, CHAN HC, HE B, et al. An antimicrobial peptide gene found in the male reproductive system of rats [J]. Science,2001, 291(5509): 1783-1785.

[5] LOU D, KOHLER H.Enhanced molecular mimicry of CEA using photoaffinity crosslinked C3d peptide [J]. Nat Biotechnology,1998, 16(5): 458-462.

[6] 趙娜. VP1與C3d3融合基因疫苗誘生CVB3特異性免疫應(yīng)答及其預(yù)防病毒性心肌炎的研究[J]. 環(huán)球中醫(yī),2013, S2: 29-30.

[7] ZHOU CX, ZHANG YL, XIAO L, et al. An epididymis-specific beta-defensin is important for the initiation of sperm maturation [J]. Nat Cell Biol,2004, 6(5): 458-464.

[8] GOR DO, DING X, LI Q, et al. Genetic fusion of three tandem copies of murine C3d sequences to diphtheria toxin fragment B elicits a decreased fragment B-specific antibody response [J]. Immunology Letters,2006, 102(1): 38-49.

[9] KOCH M, FRAZIER J, SODROSKI J, et al. Characterization of antibody responses to purified HIV-1 gp120 glycoproteins fused with the molecular adjuvant C3d [J]. Virology,2005, 340(2): 277-284.

[10] GILBERT HE, EATON JT, HANNAN JP, et al. Solution structure of the complex between CR2 SCR 1-2 and C3d of human complement: an X-ray scattering and sedimentationmodeling study [J]. J Mol Biol,2005, 346(3): 859-873.

[11] 程丹, 熊承良, 李潔, 等. 不同質(zhì)量精液精漿中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α水平和氧化應(yīng)激的關(guān)系[J]. 中華腔鏡泌尿外科雜志,2013, 7(2): 144-147.

(編輯 王 瑋)

Immunocontraceptive effects of pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice

ZHOU Qing-song, JIN Feng-shuo, LI Yan-feng, ZHANG Jun, ZHANG Ke-qin, SUN Zhong-yi

(Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

Objective To explore the immunological contraceptive effects induced by pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice. Methods After male mice were immunized with pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b,their serum IgG titres against Bin1b,the content of serum IL-2,INF-γ,IL-4 and IL-10 were detected using ELISA assays.PBS group, pSG.SS.YL group and pSG.SS.YL.Bin1b group (Bin1b group) served as control groups. Results The sperm viability, pregnancy rate of the female mice,and average litter number of the C3d3-Bin1b group were significantly lower than those of the Bin1b group.In the C3d3-Bin1b group,serum IgG titres was higher, the content of IL-2 and INF-γ decreased significantly, while the content of IL-4 and IL-10 increased markedly.Conclusion pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b has better contraceptive effects on male mice than pSG.SS.YL.Bin1b.KEY WORDS:Bin1b; contraception vaccine; C3d3

2014-07-09

2014-11-07

國家自然科學(xué)基金(No.81100546)；重慶市自然科學(xué)基金(No.CSTC,2010BB5162)

孫中義，副主任醫(yī)師、副教授.E-mail: sun200801@hotmail.com

周青松(1984-),男(漢族)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事男科學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究.E-mail: lobsper.j@163.com

R392

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-03-016