蔣琰潔，李寶坤，李開雄，盧士玲，王慶玲，蔣彩虹，樊哲新，朱敏

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

乳酸菌具有抗癌、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力、治療慢性尿道感染以及延緩衰老等功效［1］，這主要是由乳酸菌的抗氧化這一特性發(fā)揮作用。乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)［3］，人們對于功能性食品和含有益生菌的乳制品的使用越來越感興趣，他們在胃腸道疾病的預(yù)防及治療方面都有涉及。因而，乳酸菌勢必成為人們首選的新型抗氧化劑。

本文從酸奶和干酪中初步分離得到24株乳酸菌菌株，通過過氧化氫耐受性實(shí)驗(yàn)初步篩選獲得7株高耐受性的菌株。在此基礎(chǔ)上，對乳酸菌的無細(xì)胞提取物及細(xì)胞菌懸液的抗氧化性能進(jìn)行比較研究，旨在為乳酸菌抗氧化劑的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株的活化與培養(yǎng)基

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、魏斯氏菌(Weissella cibaria)和面包乳桿菌(Lactobacillus panis)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

將7株已純化的乳酸菌菌株樣品分別接種于MRS培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代2次，然后劃線接種于固體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖 20 g、MgSO40.58 g、檸檬酸氫二銨 2 g、K2HPO42 g、乙酸鈉5 g、MnSO40.25 g、吐溫1 mL，去離子水1 000 mL，pH6.2 ～6.6，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑

二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、三氯乙酸(TCA)、過氧化氫、O-菲羅啉、FeSO4、鐵氰化鉀、FeCl3、甲醇，為國產(chǎn)分析純試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722可見光分光光度計(jì)，北京精密科學(xué)有限公司;Neofuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，力康發(fā)展有限公司;BS2000S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;MA110電子分析天平，上海第三天平儀器廠;DNP-9272生化培養(yǎng)箱，上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZX-40滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;HI8424NEW酸度計(jì)，北京哈納科儀科技有限公司;KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;DK-8D恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)及無細(xì)胞提取物的制備

菌株以MRS培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24 h，傳3代后，培養(yǎng)液5 000×g離心15 min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液洗滌后重懸，調(diào)整菌數(shù)至109/mL。將所得懸液分為2組:活細(xì)胞組(IC)和無細(xì)胞提取物的制備組。將菌懸液冰浴超聲波破碎，4℃ 10 000×g離心20min，收集上清液，即為無細(xì)胞提取物(CFE)。

1.3.2 清除羥自由基實(shí)驗(yàn)

在試管中依次加入O-菲羅琳(2.5 mmol/L)、磷酸緩沖液(0.02 mol/L，pH=7.4)、蒸餾水各1 mL，充分混勻后加入FeSO4(2.5mmol/L)1 mL，混勻再加入H2O2(0.01%)1 mL，37℃水浴1 h后在536 nm處測其吸光度為A1;用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2為A0;用1 mL樣品代替1 mL蒸餾水為As［4-6］。

1.3.3 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)

1 mL樣品加入1 mL DPPH甲醇溶液(0.2 mmol/L)，放置室溫下暗反應(yīng)30 min后，在517 nm處測吸光度，以磷酸緩沖液作為空白對照［7-10］。

1.3.4 清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)

將0.1 mL樣品加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，25℃水浴預(yù)熱20 min后，加入0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，于25℃水浴反應(yīng)5 min，立即滴入2滴8 mol/L的HCl終止反應(yīng)，在325 nm處測定吸光度，用蒸餾水調(diào)零?？瞻捉M用0.1 mL H2O代替樣品即為A0［11］。

1.3.5 還原能力測定

在0.5 mL待測樣品中加入0.5 mL磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH=6.6)及0.5 mL鐵氰化鉀(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，混勻后于50℃水浴20 min，反應(yīng)后急速冷卻。再加入0.5 mL三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)，4 000×g離心10 min，取1 mL上清液，加入蒸餾水和FeCl3(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)各1 mL，混勻后靜置10 min。在700 nm處測定吸光度，吸光度越大代表樣品的還原能力越強(qiáng)［12］。

1.3.6 亞鐵離子螯合能力測定

在試管中依次加入0.1 mL抗壞血酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)，0.1 mL FeSO4(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，1 mL 0.2mol/L NaOH混勻后，混合液中加入0.5 mL待測樣品，于37℃水浴20 min后，三氯乙酸沉淀蛋白3 000×g離心10 min，取0.2 mL上清液加入2 mL O-菲羅琳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)，10 min后在510 nm處測定吸光度，以磷酸緩沖液作為空白對照［13，14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除羥自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生命體在代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生許多自由基，其中羥自由基活性最強(qiáng)，因而氧化能力也極強(qiáng)。所以，本文主要研究乳酸菌對羥自由基的清除能力以確定其抗氧化效果。

由圖1、圖2可知，7株乳酸菌都存在一定的羥自由基清除能力，面包乳桿菌的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物的羥自由基清除能力均為最強(qiáng)，和其余幾株乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。無細(xì)胞提取物的羥自由基清除能力與完整細(xì)胞液相比要弱很多。因而，乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)主要存在于菌體表面和代謝產(chǎn)物中，而不是細(xì)胞內(nèi)。另外，不同的乳酸菌具有不同的羥自由基清除能力，同種乳酸菌12-4、15和24-7之間的羥自由基清除能力差異并不顯著，這可能是不同乳酸菌所含活性物質(zhì)不同所決定的。

2.2 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DPPH紫外分光測定法是一種常見的用來評價(jià)和篩選待測樣抗氧化效果的有效方法，常用來評價(jià)和檢測待測物的抗氧化能力［15］。在本實(shí)驗(yàn)中加入了乳酸菌的完整細(xì)胞或無細(xì)胞提取物，通過對檢測乳酸菌對DPPH自由基清除能力的高低可以顯示出其抗氧化能力的強(qiáng)弱。

由圖3和圖4可知，7株乳酸菌的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物并不全具有一定的DPPH自由基清除能力，其中2-5的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物均不具有DPPH自由基清除能力，19-10的完整細(xì)胞液不具有DPPH自由基清除能力，其余菌株的清除力差異顯著。乳酸片球菌完整細(xì)胞液的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，與其余菌株相比差異顯著(P＜0.05);植物乳桿菌12-4無細(xì)胞提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，與其余菌株相比差異顯著(P＜0.05)。其中乳酸片球菌完整細(xì)胞液的DPPH自由基清除能力要明顯高于其他菌株，無細(xì)胞提取物的DPPH自由基清除能力要明顯低于其他菌株，說明菌株清除DPPH自由基的活性物質(zhì)存在于不同的細(xì)胞部位。綜合來看，魏斯氏菌的DPPH自由基清除能力相對較強(qiáng)。

2.3 清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

超氧陰離子自由基雖然不能直接與生物和食品體系中的脂類發(fā)生氧化反應(yīng)，但它可以在金屬離子的催化作用下發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生活性較高的羥自由基。一般此種方法常用來測定乳酸菌清除超氧陰離子自由基的能力。LIU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，人體在攝入某些乳酸菌后不僅可以降低活性氧的積累，還能降低超氧陰離子和過氧化氫的濃度。

由圖5和圖6可知，以上7株乳酸菌的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物均具有一定的超氧陰離子清除能力，完整細(xì)胞液組中的乳酸片球菌的超氧陰離子清除能力最強(qiáng)，與其余6株乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05);無細(xì)胞提取物組中的植物乳桿菌15的超氧陰離子清除能力最強(qiáng)，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。比較完整細(xì)胞組及無細(xì)胞提取物組，發(fā)現(xiàn)各菌株的完整細(xì)胞液對超氧陰離子的清除能力均高于無細(xì)胞提取物。實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌清除超氧陰離子的活性物質(zhì)大部分存在于細(xì)胞外。由實(shí)驗(yàn)可以得出，在7株乳酸菌中乳酸片球菌和植物乳桿菌15的超氧陰離子清除能力較強(qiáng)。

2.4 還原能力測定結(jié)果

研究表明，一種物質(zhì)的還原能力可以作為它是否具有抗氧化活性的重要指標(biāo)［17-19］。還原能力，是指一些酶和非酶復(fù)合物具有減少氧自由基和螯合亞鐵離子的能力，從而減少氧化反應(yīng)的發(fā)生。

由表2可知，7株乳酸菌均表現(xiàn)一定的還原能力，其中面包乳桿菌的還原能力最強(qiáng)，與其余6株乳酸菌相比還原能力差異顯著(P＜0.05);同種乳酸菌12-4、15和24-7之間的羥自由基清除能力差異并不顯著;無細(xì)胞提取物中并未檢測出任何還原能力。實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)均存在與細(xì)胞表面或代謝產(chǎn)物中，而并不存在于胞內(nèi)提取物中。

2.5 亞鐵離子螯合能力測定結(jié)果

由圖7和圖8可知，以上7株乳酸菌除了魏斯氏菌的無細(xì)胞提取物外，其余6株菌的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物都具有亞鐵離子螯合能力，完整細(xì)胞液組中的植物乳桿菌15的亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)，螯合率高達(dá)56.97%，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05);無細(xì)胞提取物組中的植物乳桿菌24-7的亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)，與其余6種乳酸菌相比差異顯著(P＜0.05)。比較完整細(xì)胞組及無細(xì)胞提取物組，發(fā)現(xiàn)各菌株的完整細(xì)胞液對亞鐵離子的螯合能力均高于無細(xì)胞提取物。實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌亞鐵離子螯合的活性物質(zhì)大部分存在于細(xì)胞外。在7株乳酸菌中，植物乳桿菌15和24-7的亞鐵離子螯合能力較強(qiáng)，這與Lee等［21］研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的抗氧化效果是通過螯合銅離子和亞鐵離子來實(shí)現(xiàn)是一致的。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)乳酸片球菌、魏斯氏菌、面包乳桿菌、植物乳桿菌和耐久腸球菌都具有一定的抗氧化活性，但彼此差異較大，即使是同一種乳酸菌如植物乳桿菌，也存在較大差異。其中，面包乳桿菌的羥自由基清除能力和還原能力最強(qiáng)，魏斯氏菌的DPPH清除能力相對較強(qiáng)，植物乳桿菌的超氧陰離子清除出能力和亞鐵離子螯合能力相對較高。。

通過研究還發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌的抗氧化能力不同且差異較大，可能是因?yàn)榫哂锌寡趸芰Φ幕钚晕镔|(zhì)種類或濃度不同;另外，同一種乳酸菌的完整細(xì)胞液和無細(xì)胞提取物的抗氧化能力也不同，這可能是具有抗氧化能力的活性物質(zhì)存在于不同的細(xì)胞部位導(dǎo)致。通過與其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果比較，本實(shí)驗(yàn)中的植物乳桿菌具有更高的抗氧化活性［6-8］。

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