張亞卓，姜思萌，魏穎，馬勇，王向紅，谷瑞增，曹珂璐

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定，071001)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

3(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

小腸上皮細(xì)胞是人體主要的防御屏障，它能夠阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)或其他組織器官。腸黏膜損傷的上皮細(xì)胞可引起炎癥、有害物質(zhì)通過(guò)率增加、黏膜損傷甚至細(xì)菌移位，重者可以導(dǎo)致多器官功能衰竭或膿毒癥。大量研究證實(shí)，小腸上皮的損傷及其導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能受損在一系列腸道受損疾病發(fā)病機(jī)制中起主要作用，如炎癥性腸?。?-2］、梗阻性黃疸［3］、急性胰腺炎［4］、酒精性肝?。?］等。引起腸黏膜屏障功能破壞的因素主要有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，以往的研究表明，過(guò)氧化氫(H2O2)能夠引起腸上皮氧化應(yīng)激并導(dǎo)致屏障功能破壞［2，4，6-8］。Caco-2細(xì)胞源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，在正常培養(yǎng)條件下其結(jié)構(gòu)和功能類似于分化小腸上皮細(xì)胞，可形成與小腸相似的緊密連接，具有微絨毛、含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系［9-10］，是體外研究腸上皮損傷修復(fù)作用的最佳模型［11］。

近年來(lái)，天然安全且具有生理活性的物質(zhì)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，生物活性低聚肽因具有較強(qiáng)的生物活性和很高的生物安全性而成為國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)。以往對(duì)低聚肽的研究以抗氧化、提高免疫力、降血壓、清除膽固醇等居多，并且以海洋膠原肽［12］、玉米低聚肽［13］、大豆活性肽［14］等為研究對(duì)象，對(duì)于小麥肽的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，關(guān)于小麥低聚肽實(shí)驗(yàn)表明，小麥低聚肽具有多種生物學(xué)功能，如抑癌活性［15］、阿片活性［16-17］、抑制 ACE 活性［18-19］等，關(guān)于小麥肽對(duì)體外腸上皮損傷修復(fù)的研究目前尚無(wú)報(bào)道。因此本研究以Caco-2細(xì)胞為對(duì)象探討小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的影響，旨在闡明小麥低聚肽的腸黏膜損傷修復(fù)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

小麥低聚肽，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司;Caco-2細(xì)胞、MEM培養(yǎng)基、細(xì)胞消化液，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心;胎牛血清，NEAA，Hepes，Gibco;苯酚紅、PBS緩沖液、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器

Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)dynex;生物安全柜，新加坡藝思高科技;CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)thermofisher;顯微鏡CKX 41，日本Olympus;流式細(xì)胞儀Accuri C6，美國(guó) BD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件為:37℃，5%CO2，培養(yǎng)液為:含10%胎牛血清、1%Hepes、1%谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶的90%時(shí)，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗，加入適量的消化液，按照1∶3傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小麥低聚肽溶液制備及實(shí)驗(yàn)分組

用PBS將小麥低聚肽粉配制成濃度為100 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。將?shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為5組:對(duì)照Ⅰ(空白組0μmol/L H2O2)、對(duì)照Ⅱ(氧化應(yīng)激組 100 μmol/L H2O2)，處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ(分別在對(duì)照組Ⅱ的條件下添加1、5、10 mg/mL小麥低聚肽)。

1.2.3 小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞活性影響試驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)期的Caco-2細(xì)胞消化，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度稀釋至1×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，分別用不同濃度的小麥低聚肽的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)不加低聚肽的空白孔，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，每孔加入100 μL、0.5 mg/mL MTT，4 h 后，吸除 MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使晶體溶解并混合均勻，490 nm測(cè)定各孔的吸光值。

1.2.4 小麥低聚肽對(duì)損傷細(xì)胞增殖以及細(xì)胞死亡率的影響

細(xì)胞接種及培養(yǎng)同1.2.3，待細(xì)胞融合后，吸除培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，按照1.2.2分組處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)12、24、48 h，吸棄培養(yǎng)液PBS清洗 2 遍，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT，4h 后，吸除MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物溶解混勻，490 nm測(cè)定各孔吸光值。

細(xì)胞死亡率的檢測(cè)采用乳酸脫氫酶作為檢測(cè)指標(biāo)，細(xì)胞接種及處理方法同上，待細(xì)胞培養(yǎng)至12、24、48 h吸取各孔上清液測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活性，試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

細(xì)胞接種及處理方法同1.2.4，待細(xì)胞培養(yǎng)至12、24、48 h，測(cè)定胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)，試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)方法按照說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，兩者有顯著性差異;P＜0.01，兩者有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞活性影響試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，各個(gè)濃度小麥低聚肽對(duì)細(xì)胞活性均產(chǎn)生了促進(jìn)作用，尤以1、5、10 mg/mL小麥低聚肽作用明顯。當(dāng)小麥低聚肽濃度為0.01 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率即達(dá)到了169.51%，與空白組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，在0.01 ～5 mg/mL內(nèi)隨著小麥低聚肽濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸增大，并且當(dāng)小麥低聚肽達(dá)到5 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)到285.74%，當(dāng)小麥低聚肽濃度大于5 mg/mL時(shí)，隨著小麥低聚肽濃度的增大促進(jìn)細(xì)胞存活率增加的作用逐漸減小，并且當(dāng)小麥低聚肽達(dá)到100 mg/mL時(shí)表現(xiàn)出一定的抑制細(xì)胞活性的作用，細(xì)胞存活率僅為86.19%，與空白組相比存活率顯著降低(P＜0.01)，由此可知，當(dāng)小麥低聚肽濃度達(dá)到一定值后隨著濃度的增加小麥低聚肽對(duì)細(xì)胞活性表現(xiàn)出抑制作用。

2.2 小麥低聚肽對(duì)損傷細(xì)胞增殖以及細(xì)胞毒性的影響

由表2可知，小麥低聚肽濃度及培養(yǎng)時(shí)間均顯著影響Caco-2細(xì)胞增殖率。在同一培養(yǎng)時(shí)間下，添加小麥低聚肽組、空白組的細(xì)胞增殖率與氧化應(yīng)激組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明 100 μmol/L H2O2對(duì)細(xì)胞造成顯著的損傷，小麥低聚肽對(duì)氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細(xì)胞仍有顯著的促進(jìn)增殖的作用，并且呈現(xiàn)隨著小麥低聚肽濃度的增大對(duì)損傷細(xì)胞增殖率影響越大;不同培養(yǎng)時(shí)間之間細(xì)胞增殖率的變化出現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)各處理組增殖率顯著性增高，尤以5 mg/mL的小麥低聚肽使細(xì)胞增殖率升高顯著，增殖率從12 h時(shí)的108.99%升高到48 h的138.05%，并且顯著高于空白對(duì)照組的112.56%。由以上可知隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、小麥低聚肽濃度的提高小麥低聚肽對(duì)損傷細(xì)胞的增殖率的影響越大，差異越顯著，說(shuō)明小麥低聚肽對(duì)細(xì)胞的增殖效應(yīng)與時(shí)間濃度正相關(guān)。

由表3可以看出，小麥低聚肽濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細(xì)胞細(xì)胞毒性有顯著的降低。與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)液中添加1 mg/mL小麥低聚肽，隨著Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞毒性即顯著降低。培養(yǎng)至48 h時(shí)5、10 mg/mL組的細(xì)胞毒性低至8.89%、9.77%，顯著低于氧化應(yīng)激組的20.65%，說(shuō)明小麥低聚肽對(duì)降低H2O2導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞毒性損傷有一定的作用。

2.3 小麥低聚肽抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表4、表5可知，空白對(duì)照組、添加小麥低聚肽組細(xì)胞裂解液中SOD、MDA含量均與氧化應(yīng)激組有差異顯著(P＜0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性緩慢增加，尤以5 mg/mL顯著，由12 h時(shí)的35.85 U/mg上升到48 h時(shí)的54.08 U/mg，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于氧化應(yīng)激組的19.05 U/mg和29.58 U/mg，說(shuō)明小麥低聚肽通過(guò)刺激細(xì)胞提高SOD酶的含量從而達(dá)到修復(fù)受損細(xì)胞的目的;但是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)MDA含量并未明顯減少，可能是一定量的MDA能刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化作用，從而保護(hù)細(xì)胞。

3 討論

小麥低聚肽是以小麥谷朊粉為原料，經(jīng)過(guò)酶解、分離、過(guò)濾、噴霧干燥等工藝制得的小分子多肽物質(zhì)，具有天然無(wú)毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，此外，小麥低聚肽中含有大量二肽、三肽等小分子肽類，在攝入后可迅速吸收并發(fā)揮作用，因而是功能食品理想的原料。在眾多生理活性中，其保護(hù)腸黏膜的活性近年來(lái)研究不多，且目前所進(jìn)行的小麥低聚肽對(duì)腸上皮細(xì)胞的研究多是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［20］，本研究采用Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，探討小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷后修復(fù)的影響，具有簡(jiǎn)單、快速、直觀、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。

H2O2是一種常見(jiàn)的強(qiáng)氧化劑，也是氧化應(yīng)激損傷的主要氧化物，正常情況下機(jī)體有氧代謝會(huì)產(chǎn)生一定量的H2O2，但會(huì)迅速被細(xì)胞中的抗氧化物酶如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等過(guò)氧化物酶清除［21］。當(dāng)細(xì)胞受外界刺激或細(xì)胞本身代謝發(fā)生異常時(shí)產(chǎn)生的H2O2過(guò)量，不能被及時(shí)清除時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，100 μmol/L的H2O2即可對(duì)Caco-2造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷［22］。LDH是穩(wěn)定的胞內(nèi)酶，氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)使細(xì)胞膜受損，LDH將會(huì)通過(guò)受損的細(xì)胞膜釋放到培養(yǎng)液中，本研究以檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH的活性差異的方法來(lái)判斷細(xì)胞毒性的程度;作為自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物以及細(xì)胞內(nèi)該反應(yīng)最具代表性的產(chǎn)物，MDA對(duì)于觀察胞內(nèi)反應(yīng)以及胞體受損程度具有舉足輕重的作用，機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度可以由胞內(nèi)MDA含量直接反應(yīng)，因此機(jī)體受損程度可以由胞內(nèi)MDA含量間接反應(yīng)［23-24］。作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能夠清除外源性或者炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧，減輕氧化物自由基對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的毒害。細(xì)胞清除氧自由基的能力可以由細(xì)胞裂解液中的SOD含量的變化間接反應(yīng)，而機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度可以由MDA、LDH含量的變化間接反應(yīng)，因此通過(guò)觀察SOD、MDA以及LDH的含量變化可以分析機(jī)體受損程度以及修復(fù)能力的強(qiáng)弱［25］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT方法檢測(cè)不同濃度小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示1、5、10 mg/mL小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖率影響最為顯著。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用100 μnol/L H2O2刺激Caco-2細(xì)胞制造氧化應(yīng)激損傷模型，并探討1、5、10 mg/mL對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞修復(fù)情況。低濃度(1 mg/mL)小麥低聚肽就能起到抗氧化應(yīng)激的作用，使得細(xì)胞毒性、脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA明顯降低，細(xì)胞增殖率、抗氧化物酶SOD顯著升高。小麥低聚肽(5 mg/mL)還能夠有效改善H2O2引起的細(xì)胞毒性，這種抗細(xì)胞毒性也可能是保護(hù)損傷細(xì)胞的一種表現(xiàn)。隨著小麥低聚肽濃度增大(＞5 mg/mL)并沒(méi)有起到更好的抗氧化效果，證明低濃度的小麥低聚肽對(duì)體外腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有顯著的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究小麥低聚肽對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷修復(fù)作用，初步證實(shí)了小麥低聚肽具有一定的促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖和保護(hù)損傷腸黏膜的作用。推測(cè)小麥低聚肽中的小分子肽類起到促進(jìn)Caco-2細(xì)胞再生以及修復(fù)受損的Caco-2細(xì)胞作用，對(duì)于腸黏膜疾病的治療以及小麥低聚肽的深度開(kāi)發(fā)具有重要意義。

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