戚順民，馬 康，吳明明，孫金海*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193)

豬H-FABP基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

戚順民1，馬 康1，吳明明2，孫金海1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193)

心肌脂肪酸結(jié)合蛋白基因(H-FABP)是影響家豬肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因之一。本研究以長(zhǎng)白豬為實(shí)驗(yàn)材料，采用RT-PCR方法克隆H-FABP基因全長(zhǎng)編碼序列，并構(gòu)建pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，48 h后進(jìn)行熒光表達(dá)檢測(cè)。獲得了豬H-FABP基因去終止密碼子全長(zhǎng)編碼序列399 bp，成功構(gòu)建pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后在PK15細(xì)胞中順利表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步從細(xì)胞水平上解析及驗(yàn)證該基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

H-FABP;真核表達(dá);融合表達(dá);長(zhǎng)白豬

肌內(nèi)脂肪(IMF),俗稱大理石花紋,是影響豬肉質(zhì)評(píng)定的一個(gè)重要指標(biāo)［1］。盡管大多數(shù)肉質(zhì)性狀的遺傳力較低,但I(xiàn)MF含量卻有著較高的遺傳力［2］,表明其可以通過育種獲得較大的遺傳改良。研究認(rèn)為,IMF含量在2.5%～3%的范圍內(nèi)豬肉品質(zhì)較好,低于1.5%會(huì)明顯降低豬肉品質(zhì)［3］。但目前對(duì)高瘦肉率和低背膘厚豬種的遺傳選育,使肌肉中IMF含量已降低至1%～1.5%。因此,如何在保證一定瘦肉率和低背膘厚的前提下,提高IMF含量成為目前商品豬品種改良的新目標(biāo)。

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)家族是一組廣泛存在于許多細(xì)胞類型胞質(zhì)內(nèi)的小分子蛋白,其中與豬肉質(zhì)密切相關(guān)的FABPs有2種類型:脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白 (A-FABP)和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (HFABP)。H-FABP主要通過參與細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能,其能與胞質(zhì)內(nèi)的脂肪酸結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂肪酸的吸收［4-6］。Gerbens等［7］研究表明,H-FABP基因的mRNA表達(dá)水平與豬IMF含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。近年來,諸多研究表明H-FABP基因多態(tài)性對(duì)豬IMF含量影響顯著［8-10］。

本研究以長(zhǎng)白豬為試驗(yàn)材料,采用基因克隆并構(gòu)建真核表達(dá)載體的方法,對(duì)長(zhǎng)白豬H-FABP基因編碼序列進(jìn)行分析并構(gòu)建H-FABP基因融合表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究豬H-FABP基因的生物學(xué)功能及改善傳統(tǒng)瘦肉型豬的肉質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

1.1 材料 長(zhǎng)白豬耳組織取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地,大腸桿菌DH5α、載體pEGFP-N1以及PK15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 所需主要儀器設(shè)備 PCR儀,電泳儀,凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng),超凈工作臺(tái),CO2培養(yǎng)箱,倒置熒光顯微鏡,水浴恒溫振蕩器,常規(guī)手術(shù)器械及玻璃器皿。

1.3 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國(guó)Thermo公司;RNAiso Plus、DNase I、Ex Tap DNA聚合酶、DNA限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I、T4 DNA連接酶和凝膠回收試劑盒購于寶生物(大連)公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒購于天根生化科技(北京)公司;胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購于美國(guó)Hyclone公司;卡那霉素、青霉素購于德國(guó)SIGMA公司;脂質(zhì)體2000購于Invitrogen公司。

1.4 H-FABP基因的克隆

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的豬H-FABP基因編碼區(qū)序列 (登錄號(hào): NM_001099931.1),應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增H-FABP基因cDNA完整編碼序列的引物,保留H-FABP基因cDNA的起始密碼子,去掉終止密碼子,并引入酶切位點(diǎn)(正向引物:5′-CCCAAGCTTATGGTG GACGCCTTCGC-3′,下劃線序列為Hind III酶切位點(diǎn);反向引物:5′-CGGGATCCTGCCTCTTTCTCGTAA GTGCG-3′,下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增目的片段大小為399 bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 H-FABP基因的擴(kuò)增與克隆 采用Trizol法抽提獲得長(zhǎng)白豬耳組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, RT-RCR方法擴(kuò)增得到H-FABP基因全長(zhǎng)編碼序列并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)?；厥占兓笈cpMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,在含氨芐抗性的固體培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h,挑取單克隆于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),采用菌液PCR和雙酶切進(jìn)行插入片段的鑒定,陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4.3 H-FABP基因序列測(cè)定及分析 在NCBI網(wǎng)站上利用在線工具BLAST對(duì)克隆得到的H-FABP基因編碼序列與GenBank上的6種動(dòng)物:人(NM_004102.3)、大 鼠 (NM_024162.1)、雞 (NM_001030889.1)、牛(NM_174313.2)、山 羊 (NM_001285701.1) 及 驢(GQ244482.1)的相應(yīng)編碼區(qū)序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.5 融合表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定

1.5.1 融合表達(dá)載體構(gòu)建 將測(cè)序鑒定正確的pMD19-T-H-FABP質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Hind III和BamH I雙酶切,膠回收H-FABP基因和pEGFP-N1載體片段,用T4連接酶16℃連接6 h,轉(zhuǎn)化DH5,在含kan+抗性的固體培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h,挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR、雙酶切鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-HFABP,并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5.2 融合表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將鑒定正確的H-FABP基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-H-FABP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞。試驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-H-FABP;陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1;空白對(duì)照組:未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h之后于熒光倒置顯微鏡下觀察,200倍放大倍數(shù)下每組隨機(jī)選取10個(gè)視野的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù),以10個(gè)視野的平均百分比表示每組PK15細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)分析 用于分析統(tǒng)計(jì)的軟件為SPSS V19.0,選用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 長(zhǎng)白豬耳組織總RNA提取 Trizol法提取長(zhǎng)白豬耳組織總RNA,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,顯示有清晰的28 S和18 S條帶(圖1)。說明提取的總RNA完整度較高,可進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.2 長(zhǎng)白豬H-FABP基因克隆及測(cè)序 通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到目的基因H-FABP,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示在399 bp處得到1條清晰的條帶(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明所獲得的豬H-FABP與GenBank(登錄號(hào): NM_001099931.1)中的相應(yīng)基因序列完全一致,證明RT-PCR擴(kuò)增獲得的目的基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所需目的基因。將目的片段回收與pMD19-T載體連接得到質(zhì)粒命名為pMD19-T-H-FABP。質(zhì)粒經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切8 h后,在399 bp和2 700 bp處顯示有條清晰的條帶(圖3),其中399 bp為目的基因片段大小,2 700 bp為載體長(zhǎng)度大小,與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 H-FABP基因生物信息學(xué)分析 將測(cè)序獲得的長(zhǎng)白豬H-FABP基因編碼區(qū)序列與GenBank中收錄的人(NM_004102.3)、大鼠(NM_024162.1)、雞(NM_00 1030889.1)、牛(NM_174313.2)、山羊(NM_001285701.1)及驢(GQ244482.1)相應(yīng)編碼區(qū)序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(表1)。發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中,該基因的同源性達(dá)86%～94%,氨基酸的同源性達(dá)88%～95%,可知H-FABP基因在不同物種之間具有較高的保守性,推斷該基因在物種遺傳進(jìn)化過程中具有重要作用。

圖2 H-FABP基因克隆瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 pMD19-T-H-FABP質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

表1 H-FABP基因在長(zhǎng)白豬和其他物種之間的同源性比對(duì)

2.4 pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,挑取陽性克隆,進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增鑒定(圖4)。融合表達(dá)載體經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切8 h后,在399 bp和4 700 bp處顯示出2條清晰的條帶(圖5),其中399 bp為目的基因的片段大小,4 700 bp為載體的長(zhǎng)度大小,與預(yù)期結(jié)果相符,測(cè)序結(jié)果證實(shí)所獲得的目的片段與GenBank中的H-FABP基因序列完全一致,說明pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體構(gòu)建正確,融合表達(dá)載體圖譜見圖6。

圖4 菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖5 pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體雙酶切結(jié)果

圖6 pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體圖譜

2.5 pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞結(jié)果 將pEGFP-N1-H-FABP融合表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,48 h后置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-HFABP融合表達(dá)載體的PK15細(xì)胞可以觀察到綠色熒光(圖7),轉(zhuǎn)染效率平均為21.28%;轉(zhuǎn)染空載體的PK15細(xì)胞,綠色熒光蛋白高表達(dá)(圖8),轉(zhuǎn)染效率平均為40.36%;未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞未觀察到綠色熒光(圖略)。

圖7 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞熒光結(jié)果圖

圖8 空載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞熒光結(jié)果圖

3 討論

生長(zhǎng)性能作為豬育種中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證新的候選基因?qū)邑i的遺傳改良有著極其重要的意義。相關(guān)研究表明,H-FABP基因可作為肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因［11］。H-FABP基因表達(dá)較為廣泛,在心臟、骨骼肌、腎臟、肺臟、乳腺、大腦、胎盤以及卵巢等部位均有表達(dá),但表達(dá)量差異較大,主要在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本研究從長(zhǎng)白豬耳組織中成功克隆其H-FABP基因編碼序列,也從側(cè)面印證了該基因表達(dá)較為廣泛的特點(diǎn)。通過其與GenBank中的人、大鼠、雞、牛、山羊及驢進(jìn)行同源性比較,筆者發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中,該基因序列的同源性達(dá)86%～94%,編碼氨基酸的同源性達(dá)88%～95%,可見H-FABP基因具有較高的保守性且氨基酸突變類型多屬于同義突變,也顯示出H-FABP基因在動(dòng)物遺傳進(jìn)化過程中對(duì)于維護(hù)機(jī)體正常生理機(jī)能具有重要意義。

本研究選用的pEGFP-N1載體中含有SV40 ori和PCMV復(fù)制原件,可在宿主細(xì)胞分裂的過程中,保證目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。GFP(綠色熒光蛋白)是一種生物發(fā)光物質(zhì),由238個(gè)氨基酸殘基組成,EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)為GFP的突變體,在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光,其熒光強(qiáng)弱取決于蛋白的含量, GFP與外源基因偶聯(lián)時(shí)一般不影響外源蛋白的構(gòu)象和功能［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn),融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(21.28%)顯著低于空載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(40.36%)。推測(cè),外源基因與EGFP基因融合表達(dá)可能會(huì)改變GFP的空間構(gòu)象,進(jìn)而影響綠色熒光的表達(dá)強(qiáng)度。

目前,國(guó)內(nèi)對(duì)于豬H-FABP基因的研究大多停留在該基因的多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析方面。本研究以PK15細(xì)胞為宿主細(xì)胞,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染帶有目的基因和綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體,探討了H-FABP基因在細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步從細(xì)胞水平上解析及驗(yàn)證該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

［1］Fiedler I,Nürnberg K,Hardge T,et al.Phenotypic variations of muscle fibre and intramuscular fat traits in longissimus muscle of F2 population Duroc×Berlin Miniature Pig and relationships to meat quality［J］.Meat Sci,2003,63(1):131-139.

［2］ Suzuki K,Irie M,Kadowaki H,et al.Genetic parameter estimates of meat quality traits in Duroc pigs selected for average daily gain,longissimus muscle area,backfat thickness, and intramuscular fat content［J］.J Anim Sci,2005,83(9):2058-2065.

［3］ Devol D L,Mckeith F K,Bechtel P J,et al.Variation in composition and palatability traits and relationships between muscle characteristics and palatability in random sample of pork carcasses［J］.J Anim Sci,1988,66(2):385-395.

［4］Haunerland N H.Fatty Acid Binding Proteins［M］.Encyclopedia of Entomology:Springer Verlag New YorkInc,2008:1416-1418.

［5］ 徐海霞,房興堂,陳宏,等.脂肪酸結(jié)合蛋白及其主要家族基因的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī),2008,40(1):94-97.

［6］陳軼霞,駱學(xué)農(nóng),王紅寧.脂肪酸結(jié)合蛋白及其生物學(xué)功能［J］.生命的化學(xué),2012,32(6):502-506.

［7］Gerbens F,Verburg F J,Van Moerkerk H T,et al.Associations ofheartand adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs［J］.J Anim Sci, 2001,79(2):347-354.

［8］ 呼紅梅,王繼英,郭建鳳,等.萊蕪豬和杜洛克豬肌肉HFABP基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量關(guān)聯(lián)分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25(4):64-68.

［9］ Cho K H,Kim M J,Jeon G J,et al.Association of genetic variants for FABP3 gene with back fatthickness and intramuscular fat content in pig［J］.Mol Biol Rep,2011,38(3):2161-2166.

［10］Chen J N,Jiang Y Z,Cen W M,et al.Distribution of H-FABP and ACSL4 gene polymorphisms and their associations with intramuscular fat content and backfat thickness in different pig populations［J］.Genet Mol Res,2014,13(3):6759-6772.

［11］Arnyasi M,Grindflek E,Jávor A,et al.Investigation of two candidate genes for meat quality traits in a quantitative trait locus region on SSC6:the porcine short heterodimer partner and heart fatty acid binding protein genes［J］.J Anim Breed Genet, 2006,123(3):198-203.

［12］程根陽,陳香美,白雪源,等.綠色熒光蛋白與人腎臟NaDC3融合基因的構(gòu)建及其在腎小管上皮細(xì)胞中的定位［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志,2003,25(3):170-173.

［13］Li Y,Li J,Lu C R,et al.The construction and identification of eukaryotic expression vector pEGFP-N1-hTERT［J］.Agri Sci Tech, 2008,9(5):50-54.

Cloning and Constructing of Eukaryotic Expression Vector of H-FABP Gene in Pig

QI Shun-min1,MA Kang1,WU Ming-ming2,SUN Jin-hai1*
(1.College of Animal Science and Technology,Qingdao Agricultural University,Shandong Qingdao 266109,China; 2.China Agricultural Uniuersity,Beijing 100193,China)

Heart fatty acid binding protein gene(H-FABP)is one of the most important candidate genes that affect pig’s intramuscular fat content.In this research,the full-length coding sequence of H-FABP gene was cloned from Landrace by RT-PCR method.pEGFP-N1-H-FABP fusion expression vector was constructed and detected by liposome-mediated transfection PK15 cells with fluorescence expression after 48 h.The whole CDS size of H-FABP was 399 bp excluding the termination codon.The pEGFP-N1-H-FABP fusion expression vector was constructed and successfully expressed in PK15 cells.The results of this trial provide a basis for parsing and verifying the biological function of this gene on cellular level.

H-FABP;eukaryotic expression;fusion expression;landrace

S828.2

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0069-05

2014-09-29;

2015-01-21

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2013ZX08006-003);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-06-022-01)

戚順民(1989-),男,在讀碩士,E-mail:1030308369@qq. com

*通訊作者:孫金海,博士,教授,主要從事細(xì)胞遺傳和分子遺傳學(xué)研究,E-mail:sunjinhai00528@sina.com.