王海樹，何文姬，宿寶貴，潘三強(qiáng)(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，廣東廣州　510632)

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mTORC2通路在苯丙胺致大鼠紋狀體損傷中的變化*

王海樹，何文姬，宿寶貴，潘三強(qiáng)△
(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，廣東廣州510632)

［摘要］目的:探討哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)通路在苯丙胺致中樞神經(jīng)損傷過程中的變化。方法:通過注射苯丙胺建立大鼠動(dòng)物模型，采用open field方法測試大鼠的自主行為活動(dòng)，用透射電鏡觀察大鼠紋狀體的超微結(jié)構(gòu)，用Western blot方法檢測mTORC2信號通路的變化，用免疫組化方法觀察mTORC2陽性神經(jīng)元的變化。結(jié)果:苯丙胺大鼠在行為學(xué)上出現(xiàn)刻板行為，紋狀體細(xì)胞和神經(jīng)纖維的超微結(jié)構(gòu)受損，磷酸化的mTORC2和蛋白激酶B(Akt)表達(dá)減少，并且磷酸化的mTORC2陽性細(xì)胞也減少。結(jié)論: mTORC2通路的抑制可能在苯丙胺致紋狀體結(jié)構(gòu)的損傷中起重要作用。

［關(guān)鍵詞］苯丙胺;紋狀體;哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2;蛋白激酶B

［修回日期］2015-03-10

Change of mTORC2 pathway in amphetamine-induced injury in rat striatum

WANG Hai-shu，HE Wen-ji，SU Bao-gui，PAN San-qiang
(Department of Anatomy，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tpsq@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To explore the change of mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2) pathway in amphetamine (AMPH) -induced injury in the central nervous system in rats.METHODS: The animal model was established by intraperitoneal injection of AMPH (2.5 mg ·kg－1·d－1).SD rats were randomly divided into control，saline and AMPH groups.The rat autonomous behaviors were tested by open field experiment.The changes of the neurons and fibers in the rat striatum were observed under transmission electron microscope.The change of mTORC2 signaling pathway in the striatum was detected by Western blot.The immunohistochemical method was applied to observe the changes of mTORC2 positive neurons in the striatum.RESULTS: The stereotyped behavior in AMPH group at 7 d and 14 d was induced.The ultrastructural injury of the neurons and fibers in the striatum was observed in AMPH group at 14 d.In the striatum，p-Rictor (S1219) expression in AMPH group was reduced compared with control group (P＜0.01)，and the protein level of p-Akt (T308) in AMPH group at 14 d was decreased (P＜0.01).The number of p-Rictor (S1219) positive cells in AMPH group at 7 d and 14 d was reduced compared with control group.The result was consistent with that of Western blot.CONCLUSION: The structural damage of the striatum induced by AMPH may be associated with the inhibition of mTORC2/Akt signaling pathway.

［KEY WORDS］Amphetamine; Striatum; Mammalian target of rapamycin complex 2; Protein kinase B

苯丙胺(amphetamine，AMPH)、3，4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺(搖頭丸)和甲基苯丙胺(冰毒)都屬于苯丙胺類興奮劑(amphetamine-type stimulants，ATS)，為合成類毒品。2013年聯(lián)合國毒品調(diào)查報(bào)告指出，ATS的吸毒者遠(yuǎn)超過鴉片、可卡因和海洛因等的吸毒人數(shù)，僅次于大麻。短期使用ATS，可使身體產(chǎn)生致幻性、高熱，以及心、肝、腎等器官損傷，長期或過量濫用可致藥物依賴性、中樞損傷和精神錯(cuò)亂等［1］。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族，是絲氨酸/蘇氨酸激酶的一種。mTOR在細(xì)胞內(nèi)有mTOR復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTORC2兩種形式［2］。mTORC1對雷帕霉素敏感，近年來研究表明，精神類藥品、大麻、鴉片和酒精引起的成癮行為、神經(jīng)調(diào)節(jié)與mTORC1密切相關(guān)［3-4］。mTORC2對雷帕霉素不敏感，由mTOR、Rictor、mLST8、mSin1、PRR5和Deptor組成。Rictor是mTORC2的特異性成分，在mTORC2復(fù)合物中起著發(fā)揮mTORC2蛋白激酶活性的作用［5］，從而使下游的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)磷酸化進(jìn)而激活A(yù)kt的各條途徑。

已知mTORC2與細(xì)胞的骨架運(yùn)動(dòng)有關(guān)［6］。但它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)系及在成癮藥物中所起的作用目前并不清楚。故本文通過注射苯丙胺建立大鼠動(dòng)物模型，探討mTORC2信號通路與苯丙胺致大鼠紋狀體損傷的關(guān)系。

材料和方法

1材料

從中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買SPF級雄性SD大鼠60只，體重160～180 g，將大鼠分為空白組、生理鹽水組，苯丙胺1 h、1 d、7 d和14 d組，每組10只。苯丙胺1 h組只給予苯丙胺注射1次，在給藥后1 h取材;苯丙胺1 d組、7 d組和14 d組分別每天給藥1次，并于末次給藥后24 h內(nèi)取材;而空白組、生理鹽水組與苯丙胺14 d組一同取材。

在大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛，麻醉后，用4℃生理鹽水80 mL和4%多聚甲醛40 mL灌注心臟，取腦后放入4%多聚甲醛中進(jìn)行后固定，作為免疫組化實(shí)驗(yàn)材料。而用生理鹽水灌注后，用2%戊二醛和4%多聚甲醛40 mL進(jìn)行灌注，取腦后固定，作為透射電鏡實(shí)驗(yàn)材料。Western blot實(shí)驗(yàn)材料則在灌注生理鹽水后，立即取紋狀體，迅速放入－80oC保存。

2方法

2.1動(dòng)物模型制作和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)苯丙胺用生理鹽水按1 g/L配置，給藥劑量為2.5 mg ·kg－1·d－1苯丙胺，生理鹽水組注射同等劑量的生理鹽水，正常對照組未給予任何處理。藥后進(jìn)行刻板行為評分，參照Sams-Dodd方法［7］進(jìn)行。以刻板行為評分≥2分以及刻板行為持續(xù)時(shí)間≥15 min為合格模型。此外，建模過程中每組選5只大鼠進(jìn)行open field測試。選擇大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡、總路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及平均速度等指標(biāo)進(jìn)行比較。

2.2透射電鏡觀察將紋狀體部位修塊，行半薄切片，用甲苯胺藍(lán)染色定位，再修塊，行超薄切片，飽和醋酸雙氧鈾染色，飽和硝酸鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察，拍照。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)組織超聲裂解，用Bradford法測蛋白含量，取30 μg蛋白上樣，恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育I抗(p-Rictor，1∶1 000，Millipore; p-Akt，1∶1 000，Cell Signaling; tubulin，1∶1 000，Bioworld)，孵育II抗(goat anti-rabbit IgG，1∶5 000，Bioworld)，ECL顯影，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

2.4免疫組織化學(xué)染色將腦行冰凍冠狀切片，片厚25 μm。用S-P試劑盒(福州邁新公司)進(jìn)行反應(yīng)，即:加A液孵育，0.01 mol/L PBS漂洗后，加B液孵育，加I抗(p-Rictor，1∶200) 4℃過夜，0.01 mol/L PBS漂洗后，加C液孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗后，加D液孵育，最后DAB顯色。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，用徠卡顯微圖像系統(tǒng)的Q-Win軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及計(jì)算面積，每個(gè)動(dòng)物取5張組織切片。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0軟件包對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對于計(jì)量資料做完全隨機(jī)分組的單因素方差分析，選擇Tukey法進(jìn)行多重比較;而對于等級資料則采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多重比較則采用Nemenyi法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1動(dòng)物的行為學(xué)變化

1.1自主活動(dòng)測試空白組與生理鹽水組比較，大鼠自主活動(dòng)總距離(distance)與運(yùn)動(dòng)速度(velocity)的差別不顯著，但運(yùn)動(dòng)時(shí)間(time)與空白組相比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明生理鹽水注射對大鼠的活動(dòng)時(shí)間還是有一定的影響，但是這種影響與苯丙胺相比較小;苯丙胺1 d、7 d和14 d組大鼠自主活動(dòng)的總距離、速度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間比空白組都顯著增加，見圖1。

Figure 1.The changes of the autonomic activities in rats induced by AMPH.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs control.圖1給藥后各組大鼠自主活動(dòng)度的比較

1.2刻板行為評分空白組和生理鹽水組相比刻板行為評分無顯著差異。而苯丙胺7 d組、14 d組與空白組比較，刻板行為評分增加，差異顯著(P＜0.01)，見表1。

表1　各組SD大鼠刻板行為評分表Table 1.Stereotyped behavior scores of the rats induced by AMPH (n=10)

2苯丙胺對大鼠紋狀體神經(jīng)元與神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)的損傷

空白組大鼠紋狀體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核完整，髓鞘層次清楚(圖2A)。苯丙胺1 d組的胞體以及髓鞘結(jié)構(gòu)與正常組相似(圖2B和2C) ;苯丙胺14 d組細(xì)胞核皺縮(圖2D)，線粒體嵴斷裂、減少(圖2E) ;髓鞘變薄、變形(圖2F)。

3苯丙胺對mTORC2/Akt信號通路的抑制

在紋狀體部位，苯丙胺1 h組p-Rictor的表達(dá)有所下降，但與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。苯丙胺1 d組、7 d組和14 d組p-Rictor的表達(dá)則受到嚴(yán)重抑制，比空白組明顯降低(P＜0.05)。苯丙胺1 h組、1 d組和7 d組p-Akt(T308)的表達(dá)與對照組相比沒有明顯變化(P＞0.05)。隨著時(shí)間延長，苯丙胺14 d組p-Akt(T308)的表達(dá)與空白組比較顯著下降(P＜0.01)，見圖3。

4苯丙胺對p-Rictor陽性細(xì)胞的影響

在紋狀體的p-Rictor(S1219)免疫陽性細(xì)胞胞核淡染，胞漿著色深?？瞻捉M和生理鹽水組之間的陽性細(xì)胞數(shù)比較無顯著差異。苯丙胺1 h組和7 h組p-Rictor的陽性細(xì)胞數(shù)與空白組相比有所減少，但無顯著差異(P＞0.05)。苯丙胺7 d組和14 d組與空白組比較，紋狀體部位的p-Rictor陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，(P＜0.01)，見圖4。

Figure 2.The ultrastructural changes of the neurons and fibers in the striatum.A: control group; B，C: AMPH group at 1 d; D～F: AMPH group at 14 d.The scale bar=2 μm.圖2大鼠紋狀體部位神經(jīng)元和神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的變化

討論

本研究顯示，注射苯丙胺后，大鼠行為活動(dòng)出現(xiàn)異常，自主活動(dòng)增加，隨著用藥天數(shù)的增加，第7天出現(xiàn)刻板行為，而且軌跡圖表明自主活動(dòng)逐漸被刻板行為取代(未在結(jié)果中顯示)。自主行為活動(dòng)增加與刻板行為的出現(xiàn)主要是腦內(nèi)DA釋放增加所致，與黑質(zhì)-紋狀體DA能神經(jīng)通路密切相關(guān)［8］。因此，紋狀體的研究對揭示苯丙胺的中樞毒性機(jī)制有重要意義。透射電鏡發(fā)現(xiàn)苯丙胺14 d大鼠紋狀體的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受到損傷，細(xì)胞核固縮，線粒體嵴斷裂。說明給予苯丙胺14 d時(shí)大鼠的紋狀體受到了較嚴(yán)重的損傷。目前認(rèn)為，苯丙胺對神經(jīng)元的毒性作用與腦內(nèi)DA的過量釋放引起的氧化反應(yīng)密切相關(guān)［1］。研究表明，苯丙胺類興奮劑可以通過DA轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入神經(jīng)末梢，從而取代神經(jīng)末梢囊泡內(nèi)的DA，導(dǎo)致DA大量釋放，通過單胺氧化酶和自身的氧化作用，產(chǎn)生超氧化物陰離子和過氧化氫，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡［9］。此外，由于苯丙胺類興奮劑具有親脂性，因此，可以進(jìn)入線粒體，促使線粒體依賴的凋亡［10］，線粒體功能異常可導(dǎo)致能量代謝障礙、鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)以及產(chǎn)生活性氧等神經(jīng)元損傷過程。

Figure 3.The results of Western blot showed the protein levels of p-Rictor (S1219) and p-Akt (T308) in the striatum.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs saline.圖3 Western blot示紋狀體p-Rictor及p-Akt蛋白的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)注射苯丙胺1 d后，紋狀體部位mTORC2磷酸化的表達(dá)顯著減少，注射至14 d，mTORC2磷酸化的表達(dá)也一直處于減少狀態(tài)，這說明短期和長期使用苯丙胺都能抑制mTORC2的活性。免疫組化顯示磷酸化mTORC2免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量在7 d后顯著減少，與Western blot結(jié)果基本一致。表明mTORC2受到抑制之后，紋狀體的神經(jīng)細(xì)胞才出現(xiàn)損傷，同時(shí)提示mTORC2的抑制可能與神經(jīng)細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。目前，國內(nèi)外還未見類似報(bào)道。由于mTORC2的上游分子不清楚，至今對mTORC2的功能及其信號通路都了解的非常少，因而，對該結(jié)果的原因及其機(jī)制還不清楚。現(xiàn)已知mTORC2可能通過蛋白激酶C調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合而影響神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)［11］，敲除mTORC2的Rictor基因會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠壽命縮短30%至40%［12］。另外，mTORC2可以直接磷酸化Akt［13］。由于Akt的功能與細(xì)胞的增殖和存活有關(guān)，它功能的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)的疾?。?4］，而且Akt的抑制與神經(jīng)元的損傷有密切關(guān)系［15］，故本文檢測了mTORC2下游分子Akt磷酸化的變化。結(jié)果表明，注射苯丙胺1 h、1 d和7 d，紋狀體部位Akt (Thr308)磷酸化的表達(dá)沒有明顯變化，注射苯丙胺至14 d，Akt(Thr308)磷酸化的表達(dá)則顯著減少。Akt的抑制沒有與mTORC2同時(shí)發(fā)生，而是在mTORC2抑制之后，提示Akt(Thr308)的磷酸化可能對mTORC2的抑制不敏感，呈延后現(xiàn)象。有1篇與本文用藥劑量接近的文獻(xiàn)報(bào)道［17］，給小鼠注射2 mg/kg苯丙胺，至第8天才觀察到紋狀體Akt磷酸化的表達(dá)下降，也說明了苯丙胺可以抑制Akt的活性，但需要較長的時(shí)間。此外，Akt的上游分子除了mTORC2外，還有PI3K、CTMP、PHLPP和PP2A 4個(gè)分子，推測其中一些分子也可能受到了苯丙胺的影響，導(dǎo)致Akt變化的復(fù)雜性，所以Akt的變化沒有與mTORC2同時(shí)發(fā)生。

Figure 4.Immunohistochemical staining showed the p-Rictor positive neurons in the straitum.The box in the first image represents the region of magnification in the striatum.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs saline.圖4紋狀體p-Rictor免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)

苯丙胺除了造成紋狀體神經(jīng)元胞體的損傷，對神經(jīng)纖維毒性更明顯，電鏡結(jié)果表明紋狀體的髓鞘變薄，結(jié)構(gòu)扭曲變形。這可能是長期使用苯丙胺導(dǎo)致精神障礙的一個(gè)重要基礎(chǔ)。眾多研究表明精神分裂癥患者腦的髓鞘結(jié)構(gòu)松散或變?。?8-19］。目前認(rèn)為精神分裂癥患者的主要原因在于神經(jīng)元之間的聯(lián)系出現(xiàn)病變以及神經(jīng)纖維的髓鞘發(fā)生了損傷，因?yàn)樗枨蕮p傷會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)纖維傳導(dǎo)失常，從而破壞了神經(jīng)元活動(dòng)的同步性，以致神經(jīng)元活動(dòng)異常［20］。

綜上所述，苯丙胺進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，導(dǎo)致了紋狀體神經(jīng)元胞體及其神經(jīng)纖維的損傷，該損傷與苯丙胺抑制mTORC2/Akt信號通路可能密切相關(guān)。這提供了一個(gè)苯丙胺損傷中樞神經(jīng)的新機(jī)理，同時(shí)也說明了苯丙胺可以作為mTORC2的上游分子，其具體作用機(jī)理尚不清楚，需要深入研究，以進(jìn)一步闡明揭示苯丙胺的中樞毒性機(jī)制。

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通訊作者△Tel: 020-85220251; E-mail: tpsq@ jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81470055)

［收稿日期］2014-12-11

［文章編號］1000-4718(2015)06-1042-06

［中圖分類號］R749

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.014