王文偉，祁小燕，張雪梅(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海000;復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海00;Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada)

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一種有效記錄成骨細(xì)胞L型鈣通道電流的穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法*

王文偉1，祁小燕3，張雪梅2△
(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海200032;2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海201203;3Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada)

［摘要］目的:探討一種有效記錄成骨細(xì)胞L型鈣通道電流的穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法。此方法使玻璃電極與細(xì)胞內(nèi)液保持電化學(xué)連續(xù)性，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，改善常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗破膜造成的破膜難和封接不穩(wěn)，以及常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗破膜后造成的封接不穩(wěn)。方法:以成骨細(xì)胞為研究對象，采用β-七葉素穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄骨細(xì)胞L型鈣通道電流。結(jié)果:采用這種穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，能有效記錄到成骨細(xì)胞上L型鈣通道電流。結(jié)論:穿孔膜片鉗技術(shù)是一種簡便而有效的記錄全細(xì)胞電流的實驗方法，該方法的建立為今后更深入的研究疾病中成骨細(xì)胞的病理生理機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］骨細(xì)胞; L型鈣通道電流;穿孔全細(xì)胞膜片鉗;β-七葉素

［修回日期］2015-04-23

Perforated whole-cell patch recording of L-type calcium current with βescin in osteoblasts

WANG Wen-wei1，QI Xiao-yan3，ZHANG Xue-mei2
(1Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032;2Department of Pharmacology，School of Pharmacy，F(xiàn)udan University，Shanghai 201203，China;3Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada.E-mail: xuemzhang@ shmu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To establish a perforated whole-cell patch-clamp technique with β-escin to record L-type calcium current (ICa，L) in osteoblasts.METHODS: ROS 17/2.8 is a rat osteoblast-like osteosarcoma cell line.β-escin was applied to the pipette solution to permeabilize the cell membrane and the perforated patch recording mode was obtained.RESULTS:β-escin at concentration of 50 μmol/L easily permeabilized the cell membrane and obtained a perforated patch recording mode in 2～7 min.This technique prevented ICa，Lrundown and preserved cytoplasmic signaling pathways.CONCLUSION:β-escin may be used as an alternative ionophore for perforated patch-clamp studies in osteoblasts and results in minimal rundown that could facilitate recordings of ICa，Lin osteoblasts.

［KEY WORDS］Osteoblasts; L-type calcium current; Perforated whole-cell patch-clamp;β-escin

L型鈣通道存在于骨細(xì)胞包括成骨細(xì)胞［1］和破骨細(xì)胞［2］中，激活該通道可以增加骨密度［1］，降低骨吸收［3］，調(diào)節(jié)機(jī)械力誘導(dǎo)的骨形成［4］，調(diào)節(jié)甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)和活性維生素D3對骨鈣平衡的作用［5］，在骨重建和骨質(zhì)疏松等骨疾病中起重要調(diào)節(jié)作用［6］。膜片鉗是研究L-型鈣通道特性的最主要方法。常規(guī)的全細(xì)胞膜片鉗方法必須在電極尖端施加負(fù)壓以吸破細(xì)胞膜，造成電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，細(xì)胞內(nèi)容物被電極內(nèi)液稀釋，甚至被吸到電極內(nèi)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物丟失，尤其那些維持離子通道活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)和能量物質(zhì)如ATP的丟失將嚴(yán)重影響細(xì)胞功能，L型鈣通道電流(ICa，L)隨記錄時間逐漸減弱的現(xiàn)象(rundown)就是這種記錄方法的缺陷所造成的典型后果［7］。穿孔膜片鉗技術(shù)是用具有膜穿孔能力的物質(zhì)多烯抗生素，這種物質(zhì)可以在細(xì)胞的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)上形成孔道，使電極內(nèi)液通過這些孔道與細(xì)胞內(nèi)液在電學(xué)上相通，且不影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，保持細(xì)胞功能的一種膜片鉗方法。穿孔全細(xì)胞膜片鉗有效地避免了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流失，胞質(zhì)滲漏極為緩慢，可以進(jìn)行長時間穩(wěn)定的記錄;同時還具有對細(xì)胞損傷小的優(yōu)點。我們實驗中用的成骨細(xì)胞ROS 17/2.8，細(xì)胞膜比較厚，很難用負(fù)壓吸破，用負(fù)壓破膜成功率僅1%。我們用β-七葉素(β-escin)在成骨細(xì)胞膜上穿孔，細(xì)胞破膜率可以提高至90%，且可以預(yù)防記錄過程中ICa，L的衰減現(xiàn)象。

材料和方法

1溶液配制

1.1電極內(nèi)液100 mmol/L KOH，150 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，2 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L K2HPO4(pH 7.4)。

1.2含β-escin的電極內(nèi)液β-escin儲存液(25 mmol/L)配法:將0.0275 g β-escin粉末溶解于1 mL雙蒸水中，分裝，放在棕色瓶中避光保存，可在－20℃保存2周。實驗當(dāng)天解凍后，將1～2 μL儲存液加入0.5 mL電極內(nèi)液中(在1.5 mL Eppendorf管中進(jìn)行)，然后漩渦混勻大約1 min。Escin在電極內(nèi)液中的終濃度為50 μmol/L，因為escin對光敏感，因此Eppendorf管應(yīng)該用鋁箔包裹。

1.3細(xì)胞外液140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，20 mmol/L HEPES(pH 7.4)。一旦全細(xì)胞封接形成，115 mmol/L BaCl2和20 mmol/L HEPES (pH 7.4)加入上述浴液中，使浴液中Ba2+的終濃度為20 mmol/L，鉀電流則被四乙胺阻斷。

2全細(xì)胞穿孔破膜記錄

在沒有正壓的情況下，將電極接近細(xì)胞表面，在接觸到細(xì)胞膜時，負(fù)壓吸引，形成高阻封接，然后放開負(fù)壓。連續(xù)施加超極化脈沖(－60 mV～－65 mV，10 ms)，持續(xù)觀察，1～3 min后β-escin對細(xì)胞膜進(jìn)行穿孔，如果電容電流增加，表明孔道逐漸形成，電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，約5 min內(nèi)可以獲得低細(xì)胞膜串聯(lián)電阻的穿孔膜片，待電容電流不再增加，便形成穩(wěn)定的穿孔膜片鉗記錄模式。

電極內(nèi)液充灌:玻璃電極(無芯玻璃電極)在拉制機(jī)(PC-10，Narishige)上兩步拉制而成，充灌電極液后，尖端阻抗為2～3 MΩ。拉制好的電極先在不含β-escin的電極液中浸約30 s，然后從電極尾部反向充灌含β-escin的電極內(nèi)液，用手指輕彈電極中部排除尖端氣泡。電極尖端越長，無β-escin電極液的深度越深，則β-escin擴(kuò)散到電極口處的時間越長，破膜時間也越長，理想的深度是在高阻封接形成數(shù)1～2 min β-escin擴(kuò)散到電極口處。含β-escin電極內(nèi)液在充灌前要振搖電極內(nèi)液充灌注射器，使β-escin分子盡量均勻分布。含β-escin電極內(nèi)液一般使用4～5 h，之后破膜效率會降低，建議4～5 h后更換新鮮的電極內(nèi)液。

結(jié)果

在室溫下，運用β-escin穿孔膜片鉗方法能成功記錄到骨細(xì)胞L型鈣通道電流，刺激方案和結(jié)果見圖1，隨著電壓的增加，電流逐漸增大，I-V曲線顯示刺激電壓在30 mV左右時電流最大(圖2)。整個記錄過程中無明顯衰減現(xiàn)象。

Figure 1.Original recording of L-type calcium currents in osteoblasts.圖1骨細(xì)胞膜L型鈣通道電流曲線

討論

穿孔全細(xì)胞膜片鉗法特點是不打破電極腔下的細(xì)胞膜片，而利用具有膜穿孔能力的物質(zhì)在細(xì)胞膜上形成高離子通透的小孔來構(gòu)成通電性回路。與全細(xì)胞記錄模式相比，穿孔全細(xì)胞記錄模式對細(xì)胞損傷小，記錄持續(xù)時間長。因為不需要打破細(xì)胞膜，防止了因負(fù)壓吸引或電擊破膜可能對封接產(chǎn)生的破壞，因此封接不容易喪失。

目前常用于膜片鉗技術(shù)的膜穿孔物質(zhì)有制霉菌素和兩性霉素B［8］，均難溶于水，充灌不當(dāng)這2種物質(zhì)在電極尖端開口處常殘存沒有溶解的顆粒，從而影響高阻封接質(zhì)量，導(dǎo)致封接成功率降低。兩性霉素B在細(xì)胞膜上形成的孔道較小(4～8 nm)，僅一價離子可以有效通過，其缺點是Mg2+、Ca2+等多價離子均不能通過細(xì)胞膜［9］，所以本實驗不用來記錄鈣電流。β-escin在細(xì)胞膜上形成的孔道較兩性霉素B大，Ca2+能有效通過，因此能進(jìn)行Ca2+電流的記錄。在Ca2+激活鉀通道電流SK2的研究中，可以將兩性霉素B與β-escin混合使用進(jìn)行穿孔膜片鉗記錄［9］。

我們實驗記錄成骨細(xì)胞ROS 17/2.8的L-型鈣通道電流，用β-escin作穿孔物質(zhì)［10］對膜的通透性具濃度依賴性［11］，其破膜難易程度與不同種類細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特性有密切關(guān)系。王華等［9］的實驗中用心房肌細(xì)胞，高濃度β-escin孔道形成早，會影響封接而不能形成有效的記錄模式。在骨骼肌細(xì)胞，推薦濃度為20～50 μmol/L β-escin［10］。我們實驗中所用的ROS 17/2.8成骨細(xì)胞比心肌、平滑肌和骨骼肌更不易破膜，20 μmol/L時的破膜成功率僅約10～20%，35 μmol/L成功率約50%，當(dāng)提高到50 μmol/L時成功率可達(dá)到90%，而且記錄穩(wěn)定持續(xù)1～2 h，無明顯衰減現(xiàn)象［12］。該方法的建立為今后更深入地研究疾病中骨細(xì)胞的病理生理機(jī)制提供了一種可靠而有效的實驗方法。

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通訊作者△Tel: 021-51980046; E-mail: xuemzhang@ shmu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81370979)

［收稿日期］2015-01-30

［文章編號］1000-4718(2015)06-1150-03

［中圖分類號］R33-33; R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.033