景 寧，康 晉，張耀宏，康永祥

桃兒七愈合組織的誘導(dǎo)及植株再生

景 寧1，康 晉2，張耀宏3，康永祥1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程學(xué)院，陜西 楊凌712100；3.國家林業(yè)局西北林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，陜西西安710048）

以桃兒七Sinopodophyllum hexandrum成熟種胚為材料，研究了不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素（噻苯隆TDZ和6-芐氨基腺嘌呤6-BA）和生長素（萘乙酸NAA和吲哚乙酸IAA）對桃兒七愈合組織誘導(dǎo)和不定芽分化及無菌苗生根的影響，建立了完整組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明：在添加0.5 mg·L-1TDZ+500 mg·L-1水解酪蛋白（CH）的MS （Murashige和Skoog）培養(yǎng)基中，成熟種胚愈合誘導(dǎo)率最高，為97.8%，顯著高于其他處理。在添加0.5 mg·L-1TDZ的繼代培養(yǎng)基中，出現(xiàn)球形胚和心形胚，但繼代培養(yǎng)褐化嚴(yán)重，添加谷胱甘肽160 mg·L-1能顯著抑制褐化現(xiàn)象。在附加1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+500 mg·L-1CH的分化及增殖培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率最高，為53.3%，且增殖芽數(shù)最高為5.2。在添加0.5 mg·L-1NAA，0.5mg·L-1IAA等2種處理均可誘導(dǎo)生根，以MS+0.5 mg·L-1IAA生根率最高，為22.4%。圖1表3參13

植物學(xué)；桃兒七；組織培養(yǎng)；愈合組織；不定芽；褐化

桃兒七Sinopodophyllum hexandrum小檗科Berberidaceae桃兒七屬Sinopodophyllum，多年生草本，“太白七藥”之一，具有祛風(fēng)除濕，止咳止痛，活血解毒的功效，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，心胃痛，風(fēng)寒咳嗽，月經(jīng)不調(diào)等癥狀。桃兒七根莖中含有的鬼臼毒素是合成GP7，VP-16（etoposide），VM-26（teniposide）和NK611等抗癌藥物的起始物質(zhì)［1］。桃兒七殘存于東亞，生長地域受限，呈零星分布，由于根狀莖與果實入藥、種子萌發(fā)率低、生長發(fā)育遲緩和人工栽培較為困難，以及過度采挖，使得自然繁殖十分困難，隨著植被的破壞而導(dǎo)致其生境的改變，植株日益減少，分布區(qū)日漸縮減，造成資源急劇減少。因此，進(jìn)行桃兒七離體培養(yǎng)和快速繁殖研究不僅能夠保存種質(zhì)資源，還能夠解決其繁殖問題，加快繁殖速度，這在理論和實踐上均具有重要意義。桃兒七的組織培養(yǎng)前人已做了部分研究，國外已有報道［2-5］，中國在此方面雖有報道［6-9］，但僅停留在愈合組織和無菌苗的誘導(dǎo)及芽生芽組織培養(yǎng)途徑，尚未建立由愈合組織誘導(dǎo)不定芽再生根的完整組織培養(yǎng)體系。同時，組織培養(yǎng)過程中存在愈合組織生長緩慢，誘導(dǎo)率低，生長停滯，分化能力較弱，繼代培養(yǎng)不穩(wěn)定，極易褐化等問題，使得桃兒七組織培養(yǎng)過程受阻。本研究以桃兒七成熟種胚為外植體，對愈合組織的誘導(dǎo)、褐化、不定芽的分化及生根問題進(jìn)行研究，以期建立器官發(fā)生途徑完整的植株再生體系，為工廠化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)，同時也為其他草本類植物再生體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2012年8月在太白山采集的桃兒七成熟果實，并放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌材料的建立 剝?nèi)√覂浩吖麑嵵械姆N子，流水沖洗1 h，于超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒30 s，質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的氯化汞（HgC12）消毒25 min，再用無菌水沖洗3～5次。無菌條件下，用解剖刀剝?nèi)》N胚，水平接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.2 愈合組織誘導(dǎo)和繼代 以 M S（Murashige and Skoog）為基本培養(yǎng)基， 單獨(dú)添加 0（ck），0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg·L-1噻苯隆（TDZ），研究它對愈合組織誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)7 d時開始觀察生長情況。培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)。將生長良好的愈合組織切成約1 cm3左右的小塊，接于附加0.5 mg·L-1TDZ 的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈合組織再分化。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)。

1.2.3 不定芽的分化和增殖 將切成小塊的愈合組織轉(zhuǎn)接至以MS為培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基中，同時添加1.0，1.5，2.0 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和0.2，0.5，1.0 mg·L-1萘乙酸（NAA）的不同配比，進(jìn)行不定芽的分化與增殖。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)7 d后進(jìn)行光培養(yǎng)。

1.2.4 根的誘導(dǎo) 叢生芽長至2 cm時，切割成單芽轉(zhuǎn)入以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5 mg·L-1吲哚乙酸（IAA）和0.5 mg·L-1NAA的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根的分化。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)。60 d后統(tǒng)計生根率。以上所有培養(yǎng)基均添加瓊脂6 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH 5.8及水解酪蛋白（CH）500 mg· L-1。光培養(yǎng)條件為（25±1）℃，補(bǔ)充光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。接種5瓶·處理-1，培養(yǎng)物3個·瓶-1，重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ對桃兒七愈合組織誘導(dǎo)的影響

桃兒七胚接種在含TDZ的MS培養(yǎng)基上，7 d后種胚明顯膨大伸長，14 d時，伸長的胚軸表面有較緊實顆粒狀愈合組織生成，繼續(xù)培養(yǎng)愈合組織生長迅速，并逐漸變得較疏松且呈淡綠色（圖1A）。培養(yǎng)50 d時統(tǒng)計誘導(dǎo)率（表1）。結(jié)果表明：桃兒七愈合組織的誘導(dǎo)必須依賴于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在不含植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中不能誘導(dǎo)愈合組織的形成。在不同質(zhì)量濃度的TDZ處理下，桃兒七愈合組織誘導(dǎo)率存在極顯著差異，隨著TDZ質(zhì)量濃度增加，誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢。愈合組織誘導(dǎo)率變異幅度為44.5%～97.8%。TDZ質(zhì)量濃度為 0.1 mg·L-1時，誘導(dǎo)率最低，為44.5%；TDZ質(zhì)量濃度增加至0.5 mg·L-1時，愈合誘導(dǎo)率最高，達(dá)97.8%，顯著高于其他處理；隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，愈合組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢。上述結(jié)果表明：誘導(dǎo)桃兒七外植體形成愈合組織的過程中，在培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的TDZ能誘導(dǎo)愈合組織的形成，但質(zhì)量濃度過高反而會起抑制作用。

表1 噻苯隆對愈合誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of TDZ concentration on callus induction

2.2 TDZ對桃兒七愈合組織繼代的影響

將誘導(dǎo)出的愈合組織接種到含0.5 mg·L-1TDZ的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每40 d繼代1次。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TDZ能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。培養(yǎng)20 d左右，愈合組織切口邊緣形成簇生的愈合組織。培養(yǎng)40 d左右，周圍出現(xiàn)松散的大顆粒狀乳白色的胚性愈合組織，連接極為松散，很容易從愈合組織上剝離，繼續(xù)培養(yǎng)逐漸出現(xiàn)球形胚和心形胚（圖1B）。再繼續(xù)培養(yǎng)60 d左右發(fā)現(xiàn)愈合組織產(chǎn)生的體細(xì)胞胚停滯生長，并逐漸死亡，未見魚雷和子葉期體細(xì)胞胚的出現(xiàn)。

2.3 添加物對桃兒七愈合組織繼代階段褐化的影響

愈合組織的誘導(dǎo)過程未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但在愈合的繼代階段卻極易褐化。因此解決褐化現(xiàn)象是桃兒七組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵問題。為了降低褐化率，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度谷胱甘肽（GSH）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），觀察它們對褐化的影響，40 d后統(tǒng)計褐化率（表2）。實驗結(jié)果表明：GSH和PVP都能降低褐化率，隨著GSH質(zhì)量濃度增加，褐化率降低。添加20 mg·L-1GSH的培養(yǎng)基，10 d后未出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象，15 d左右部分愈合開始褐化，30 d時，愈合組織周圍培養(yǎng)基變褐色。160 mg·L-1GSH時，培養(yǎng)20 d后，個別愈合組織開始出現(xiàn)褐化，但程度較輕，褐化率為13.7%，抑制褐化效果顯著高于其他處理，能夠很好地抑制褐變，且愈合組織生長健壯。2 000 mg·L-1PVP時，褐化率為16.3%，抑制褐化作用不如GSH，同時也會抑制愈合組織生長。因此，本實驗最佳抑制褐化的方案是添加160 mg·L-1GSH。

表2 不同添加物及其質(zhì)量濃度對愈合組織褐化的影響Table 2 Effect of different additives and concentration on the browning of callus

2.4 不同種類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其質(zhì)量濃度對桃兒七不定芽分化的影響

將桃兒七種胚誘導(dǎo)的愈合組織接種在添加不同質(zhì)量濃度6-BA及NAA的MS培養(yǎng)基上（表3），50 d分化培養(yǎng)，處理8和處理9愈合組織表面開最先出現(xiàn)綠色小芽點(diǎn)，之后20 d其他處理出現(xiàn)芽點(diǎn)。70 d時，處理8先分化出不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)，各處理均可分化出不定芽。處理1和處理2不定芽瘦弱，處理9有玻璃化現(xiàn)象。在原有培養(yǎng)基上增殖，實驗結(jié)果表明：不同處理下芽分化率和增殖芽數(shù)存在極顯著差異，分化及增殖與6-BA和NAA質(zhì)量濃度有關(guān)。當(dāng)1.0 mg·L-16-BA時，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，芽分化率和增殖芽數(shù)呈上升趨勢；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1時，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，芽分化率和增殖芽數(shù)呈下降趨勢；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，芽分化率和增殖芽數(shù)先升高后下降。在添加1.0 mg·L-16-BA， 0.2 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，芽誘導(dǎo)率及增殖芽數(shù)最低，分別為23.2%和1.0。在添加2.0 mg·L-16-BA，0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，芽分化率為60.4%，增殖芽數(shù)為5.2，顯著高于其他處理，且芽生長健壯，叢生芽數(shù)量多（圖1C）。

2.5 生根培養(yǎng)

將不定芽切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。25 d后，添加IAA的處理基部膨大，有突起，根開始長出。30 d時，添加NAA的處理開始長根，60 d時統(tǒng)計生根率。實驗結(jié)果表明：這2種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)根的生成（圖1D），但生根時間及生根率不同。添加0.5 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基生根率最高，為22.4%，只有1條不定根，較短且粗。添加0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基，生根率為16.7%，只有1條根，短基部腫大，且有愈合組織長出。

表3 不同質(zhì)量濃度6-芐氨基嘌呤與萘乙酸對芽分化及增殖的影響Table 3 Effect of different concentrations 6-BA and NAA on bud differentiation and multiplication

圖1 桃兒七組織培養(yǎng)再生過程Figure 1 Regeneration process of Sinopodophyllum hexandrum from tissue culture

3 結(jié)論與討論

影響愈合組織誘導(dǎo)及生長的因素有多種，如外植體類型、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、pH值、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等，其中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈合誘導(dǎo)極為重要［10］。我們研究了TDZ對愈合組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：桃兒七愈合組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1TDZ+500 mg·L-1CH，愈合誘導(dǎo)率為97.8%，高于漆燕玲等［7］的實驗結(jié)果（36.67%），解決了桃兒七愈合誘導(dǎo)率低的難題。TDZ作為一種高效細(xì)胞分裂素，近年來被廣泛用于植物組織培養(yǎng)中，具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，許多難以再生的植物應(yīng)用TDZ可獲得體細(xì)胞胚和再生植株［11］。TDZ在桃兒七愈合組織的誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，低質(zhì)量濃度TDZ易誘導(dǎo)出芽， 而高質(zhì)量濃度過高會抑制愈合組織的產(chǎn)生。在添加0.5 mg·L-1TDZ繼帶培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)出胚性愈合組織，觀察為球形期和心形期，但在心形期出現(xiàn)生長停滯，有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑還有待進(jìn)一步研究。

桃兒七愈合組織繼代過程極易褐化，致使組織培養(yǎng)無法繼續(xù)進(jìn)行，這是桃兒七無性繁殖的一大難題。前人研究認(rèn)為組織培養(yǎng)過程中褐變是由于培養(yǎng)物含有豐富的多酚化合物，在多酚氧化酶的作用下發(fā)生酶促褐變反應(yīng)生成有毒的醌類物質(zhì)［12］。谷胱甘肽（GSH）能對多酚氧化酶產(chǎn)生抑制效應(yīng)，對褐變反應(yīng)抑制效果明顯，且能起促進(jìn)生長分化［13］。前人采用PVP和活性炭等吸附劑降低桃兒七褐化率［8］，但吸附劑同時會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，影響愈合組織生長。我們采用GSH能顯著降低褐化率，質(zhì)量濃度為160 mg·L-1時，抑制褐化效果最優(yōu)，且愈合增殖快，生長良好。本研究添加不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA進(jìn)行增殖實驗，均有不定芽形成，當(dāng)2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA時，芽誘導(dǎo)率最高，增殖芽數(shù)多且生長健壯。但在生根過程中，生根率較低，生根效果仍不理想。這也是今后研究的重點(diǎn)。

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Callus induction and plant regeneration in Sinopodophyllum hexandrum

JING Ning1，KANG Jin2，ZHANG Yaohong3，KANG Yongxiang1
（College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China;2.Information Technology Institute,Yangling Vocational&Technical College,Yangling 712100,Shaanxi,China;3.Northwest Institute of Forest Inventory,Planning and Design,State Forest Administration，Xi’an 710048,Shaanxi,China）

To protect and exploit the endangered medicinal plant Sinopodophyllum hexandrum，a rapid regeneration system of tissue cultue was established.The effects of cytokinins ［thidiazuron （TDZ）and 6-benzylaminopurine（6-BA）］and auxins［naphthalene acetic acid（NAA）and indole-3-acetic acid（IAA）］on callus induction,adventitious bud induction,and rooting were studied.Using mature embryos of Sinopodophyllum hexandrum as explants Murashige and Skoog medium （MS）+0.5 mg·L-1TDZ was used to induced embryogenic callus from primary callus so that embryogenic callus developed into globular embryoid and heart-stage embryoid.Results showed differences in percentages for mediums causing callus induction for S.hexandrum with TDZ concentrations of 0.5 mg·L-1TDZ and 500 mg·L-1casein hydrolysate（CH）having the best callus induction rate of 97.8%.To avoid brownness of callus a medium of 160 mg·L-1glutathione（GSH）was used.The optimum medium for adventitious bud differentiation and proliferation was MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+500 mg·L-1CH with the highest induction rate of 53.3%and 5.2 multiple shoots.Two treatments of 0.5 mg·L-1NAA and 0.5 mg·L-1IAA induced roots,but the most suitable medium was MS+0.5 mg·L-1IAA having a rooting rate of 22.4%.The rapid propagation system of Sinopodophyllum hexandrum has been preliminar-ily established,which provide theory foundation for biotechnology breeding and technical guidance for largescale production［Ch,1 fig.3 tab.13 ref.］

botany;Sinopodophyllum hexandrum;tissue culture;callus;adventitious buds;browning

S718.3；Q945.5

A

2095-0756（2015）01-0162-05

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報，2015，32（1）：162-166

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.024

2014-01-24；

2014-04-02

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（200904004）

景寧，從事植物組織培養(yǎng)研究。E-mail：jingning1202@163.com。通信作者：康永祥，教授，博士生導(dǎo)師，從事森林植物學(xué)研究。E-mail：kangchenj@yahoo.com.cn