崔文寧, 朱淑新, 孟靜靜, 王 燦, 王 茜, 王芳芳

(衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北 衡水 053000)

‘中矮1號(hào)’是中國(guó)農(nóng)科院果樹(shù)研究所從‘錦香’梨的實(shí)生苗后代選育出來(lái)的第1代優(yōu)良矮化砧木,東方梨的栽培種親和性好,矮化作用明顯,大大促進(jìn)了我國(guó)梨的矮砧密植栽培和設(shè)施化栽培的發(fā)展,具有巨大的社會(huì)效益。但其自根繁殖困難,離體組織擴(kuò)繁是其有效的繁殖途徑之一。蘋果、梨等薔薇科植物多酚類物質(zhì)含量高,多酚氧化酶活性強(qiáng),組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體褐化現(xiàn)象嚴(yán)重,目前已有很多相關(guān)的研究報(bào)道[1-3]。褐化是指在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,組織中的酚類物質(zhì)被氧化成黑褐色的醌類物質(zhì)的過(guò)程[4]。褐化現(xiàn)象是影響植物組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)鍵影響因素[5],雖然關(guān)于植物組培中褐化的研究很多,也取得了一些進(jìn)展,但關(guān)于‘中矮1號(hào)’離體組培的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)以‘中矮1號(hào)’葉片為試材,首次較系統(tǒng)的研究了不同類型的防褐劑對(duì)其抑制效果研究,擬為后續(xù)‘中矮1號(hào)’的離體快繁研究解決瓶頸問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選自河北省武邑縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)‘中矮1號(hào)’梨砧木種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

于2022年4月中旬清晨采集‘中矮1號(hào)’中度成熟葉片(展葉15 d左右,綠色),放于500 ml大燒杯中,帶回實(shí)驗(yàn)室后用自來(lái)水流水沖洗,在不破損葉片的前提下,用軟毛牙刷輕輕刷掉葉片上的灰塵和小絨毛,然后流水沖洗1 h,隨后用1%的吐溫加洗衣粉水溶液完全浸泡葉片5～10 min,隨后再用自來(lái)水流水沖洗1 h,最后用0.1%的HgCl2浸泡消毒10～15 min。

試驗(yàn)采用單因素平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。防褐劑選取AgNO3(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L)、活性炭AC(0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L)、Na2S2O3(0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L)、聚乙烯絡(luò)烷酮PVP(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、8.0 g/L)、維生素C(0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L),設(shè)置不添加任何防褐劑處理做對(duì)照。消毒完畢的梨葉片剪成1 cm2小塊接種于培養(yǎng)基上,每處理接種20瓶,每瓶4個(gè)外植體,3次重復(fù)。

所有試驗(yàn)均采用MS培養(yǎng)基,于高壓滅菌鍋121 ℃高溫滅菌20 min,接種后每隔1 d同一時(shí)間統(tǒng)計(jì)葉片褐化情況,14 d后試驗(yàn)結(jié)束。

褐化率=發(fā)生褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%,所得數(shù)據(jù)用Excell和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對(duì)褐化率的影響

接種1 d后外植體開(kāi)始出現(xiàn)褐化,3 d后褐化增多,但褐化處表面無(wú)褐色物質(zhì)出現(xiàn)(詳細(xì)情況詳見(jiàn)表1)。14 d后統(tǒng)計(jì)褐化率可知,較低濃度的AgNO3對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片的褐化抑制情況較明顯,隨著AgNO3濃度增加,褐化率增加。0.1 mg/L的處理防褐效果最好,葉片褐化率最低為22.50%,1.0 mg/L的處理褐化最嚴(yán)重,褐化率最高為47.50%。

表1 不同濃度 AgNO3對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片褐化率的影響

2.2 AC對(duì)褐化率的影響

AC處理當(dāng)天外植體即出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,3 d后褐化嚴(yán)重,褐化部位表面顏色加深,第7天時(shí)出現(xiàn)褐色物質(zhì)。由表2可知,14 d后0.2 g/L的AC對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片的防褐效果最好,褐化率為28.75%,表面無(wú)褐色物質(zhì)出現(xiàn)。其他處理組防褐效果依次為0.05 g/L>0.1 g/L> 0.3 g/L>0.5 g/L>1.0 g/L。

表2 不同濃度AC對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片褐化率的影響

2.3 Na2S2O3對(duì)褐化率的影響

接種當(dāng)天開(kāi)始出現(xiàn)褐化,第2天時(shí)褐化迅速加劇,第14天試驗(yàn)結(jié)束時(shí),大部分外植體褐化部位邊緣已出現(xiàn)褐色沉積物,培養(yǎng)基接觸部位已被浸染成黃褐色。由表3可知：所有Na2S2O3處理的抗褐化效果都不算太好。相比來(lái)說(shuō),0.5 mg/L的處理組抗褐化效果最佳,為30.00%;10.0 mg/L的處理效果最差,高達(dá)61.25%。

表3 不同濃度Na2S2O3對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片褐化率的影響

2.4 PVP對(duì)褐化率的影響

PVP處理組接種當(dāng)天即有部分出現(xiàn)褐化情況,第7天時(shí)1.0 g/L處理組外植體褐化邊緣出現(xiàn)褐色物質(zhì)沉積,14 d時(shí)有些已完全褐化、死亡。由表4可以看出,PVP的抗褐化效果隨著濃度的增加越來(lái)越差,0.5 g/L的PVP處理組抗褐化效果最佳,為25.00%;8.0 g/L的處理組效果最差,高達(dá)71.25%,且部分培養(yǎng)基已被嚴(yán)重褐化浸染。

表4 不同濃度PVP對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片褐化率的影響

2.5 維生素C對(duì)褐化率的影響

維生素C處理當(dāng)天僅有少量外植體邊緣出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,第3天時(shí)褐化情況逐漸加劇,第14天試驗(yàn)結(jié)束時(shí),維生素C處理組的外植體褐化情況是最輕的。由表5可知：維生素C所有處理組的褐化率都在50.00%以內(nèi),0.05 g/L的抗褐化效果是最好的,為18.75%,且沒(méi)有整個(gè)外植體完全褐化的現(xiàn)象;隨著維生素C濃度的增加,褐化逐漸嚴(yán)重。

表5 不同濃度維生素C對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片褐化率的影響

2.6 CK的褐化率

不添加任何防褐劑的3個(gè)重復(fù)組褐化現(xiàn)象都很嚴(yán)重,接種當(dāng)天即出現(xiàn)大部分褐變,第5天時(shí)大部分完全褐化死亡,第14天結(jié)束時(shí),褐變率都在60.00%以上,最高可達(dá)76.25%,且大部分培養(yǎng)基受褐色物質(zhì)侵染。由此可見(jiàn),防褐劑的添加對(duì)‘中矮1號(hào)’葉片組培中的褐變抑制效果明顯。

表6 CK對(duì)‘中矮1號(hào)’褐化率的影響

3 結(jié)果與分析

褐化現(xiàn)象是薔薇科植物組織培養(yǎng)中常見(jiàn)問(wèn)題,酚類物質(zhì)被氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用,導(dǎo)致愈傷組織褐變并影響細(xì)胞代謝[6],所以,解決褐化問(wèn)題是組培成功的關(guān)鍵。文曉鵬等[7]在刺梨的愈傷組織誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加一定濃度的AC可以有效控制刺梨褐化的產(chǎn)生;在本試驗(yàn)中,添加了防褐劑處理的褐化情況都相比對(duì)照有所減輕,褐變時(shí)間和程度也有所延遲。AgNO3、AC和維生素C處理組的褐化率都在50.00%以內(nèi),其中以維生素C 0.05 g/L的抗褐化效果是最好的,為18.75%,且沒(méi)有整個(gè)外植體完全褐化的現(xiàn)象,是最佳的防褐劑。本研究結(jié)果和高疆生[8]在‘新梨7號(hào)’組培快繁研究中的結(jié)果是一致的。

褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生有內(nèi)外多重因素,與外植體的基因型、母體年齡、取材部位、取材時(shí)間及大小等都有密切關(guān)系[9]。另外,褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累也是導(dǎo)致外植體褐變率增加的一個(gè)重要因素[10],在本試驗(yàn)中也是很明顯的一個(gè)褐變現(xiàn)象。MS和1/2 MS等固體培養(yǎng)基不利于醌類等毒害物質(zhì)的擴(kuò)散,導(dǎo)致其短時(shí)間內(nèi)毒素高濃度聚積,更加劇了外植體的褐化,所以,更換液體培養(yǎng)基的研究將會(huì)作為下一步工作的重點(diǎn)。