許常旭　陳莉　査曉明

摘要：MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化，尤其在多種腫瘤細(xì)胞中異?；钴S。BRAF激酶是Raf家族在MAPK信號通路中最重要的亞型，其過多表達(dá)或突變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，同時它的易激活、易突變和基礎(chǔ)酶活高等特點(diǎn)使其成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱門靶標(biāo)。因此，基于BRAF靶標(biāo)的抗腫瘤抑制劑日益受到研究者的關(guān)注。本文對近來年國內(nèi)外研究的BRAF抑制劑作一綜述

關(guān)鍵詞：BRAF激酶；BRAF抑制劑；抗腫瘤

促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）是人體內(nèi)最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Raf是MAPK通路中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，承接上游Ras信號，傳遞給下游MEK/ERK，影響著細(xì)胞的生長和分化。BRAF作為Raf家族在MAPK信號通路中最重要的亞型，其過量表達(dá)或突變都可能誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1]。因此基于BRAF靶標(biāo)的BRAF抑制劑已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本文就近幾年國內(nèi)外對BRAF抑制劑在抗腫瘤方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 BRAF激酶及活性調(diào)節(jié)

BRAF激酶包含3個保守區(qū)域，分別是RAS結(jié)合域、富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。它的催化活性中心包括鉸鏈區(qū)（hinge region， hinge）、磷酸環(huán) （phosphate-binding loop， P-loop）、αC螺旋（αC helix） 以及活化環(huán)（activation loop， A-loop），并且與ATP結(jié)合位點(diǎn)有部分重合。同時，它存在活性（Type I）和非活性（Type II）兩種構(gòu)象。當(dāng)處于Type I狀態(tài)時，A-loop處于打開狀態(tài)，但當(dāng)A-loop起點(diǎn)的三個保守氨基酸（Asp594-Phe595-Gly596）組成的DFG基序圍繞Asp594向αC helix方向旋轉(zhuǎn)8A，出現(xiàn)一個疏水結(jié)合區(qū)（也稱為變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)），則轉(zhuǎn)變成Type II構(gòu)象。正常情況下，BRAF依靠P-loop與A-loop之間的疏水作用而維持著Type II構(gòu)象，但當(dāng)活化的Ras將BRAF招募至細(xì)胞膜時，A-loop上的Ser599和Thr602發(fā)生磷酸化，破壞了兩者的穩(wěn)定作用，DFG基序發(fā)生旋轉(zhuǎn)，BRAF轉(zhuǎn)變?yōu)門ype I構(gòu)象[2]。

BRAF在7～8%的腫瘤細(xì)胞中存在突變，其中90%是braf基因外顯子15的第1799位核苷酸T突變?yōu)锳，導(dǎo)致其編碼的600位纈氨酸被谷氨酸取代，即BRAFV600E。BRAFV600E突變模擬了野生BRAF S599/T602（BRAFWT）的磷酸化，破壞P-loop和A-loop之間的疏水作用，使BRAF在沒有上游Ras激活的作用下仍然處于異常激活狀態(tài)。這種突變使得BRAFV600E的激酶活性是BRAFWT的500倍，能持續(xù)性激活MEK/ERK信號通路，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移。

2 BRAF抑制劑

目前，根據(jù)抑制劑與激酶的不同構(gòu)象相互作用，可將BRAF抑制劑也可分為I型抑制劑和II型抑制劑。

2.1 I型抑制劑 型抑制劑結(jié)合BRAF的Type I構(gòu)象，是ATP競爭性抑制劑。它主要通過模擬ATP的腺嘌呤環(huán)與鉸鏈區(qū)形成氫鍵作用，錨定在激酶片層間，伸展開來的疏水基團(tuán)占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)，而起到抑制激酶活性的效果。目前已成功上市的I型抑制劑是Vemurafenib （PLX4032）和Dabrafenib （GSK-2118436）。

2.1.1 Vemurafenib （PLX4032，1）

Vemurafenib是一種新型的特異性BRAFV600E口服抑制劑，于2011年8月被FDA批準(zhǔn)用于治療BRAFV600E突變的晚期轉(zhuǎn)移性或不能切除的黑色素瘤。該藥物是片段藥物設(shè)計原理的經(jīng)典案例：Plexxikon公司對200萬個小分子進(jìn)行激酶抑制率初篩、共晶分析得到一個廣譜的激酶抑制劑母核--7-氮雜吲哚（7-azaindole，2）；再通過計算機(jī)輔助設(shè)計、化學(xué)結(jié)構(gòu)改造得到特異性BRAFV600E抑制劑先導(dǎo)物--PLX4720（3）；最后為改善藥代動力學(xué)性質(zhì)在母核5位插入一個苯環(huán)得到Vemurafenib[3]。

Vemurafenib作為首個治療黑色素瘤的個體化靶向藥物，療效迅速，治療反應(yīng)率良好；但靶標(biāo)的專一性使其對機(jī)體的代償作用和信號旁路無效，黑色素瘤患者常在Vemurafenib治療8～9月后出現(xiàn)耐藥性問題。目前，這種耐藥性有望通過聯(lián)合用藥得到解決，GSK與Roche正在合作進(jìn)行Vemurafenib的靶向療法聯(lián)合易普利姆瑪（Ipilimumab）的免疫療法來治療晚期黑色素瘤的臨床試驗(yàn)[4]。

Steve等[5]根據(jù)生物電子等排原理改造Vemurafenib得到磺酰胺類BRAF激酶抑制劑4和5，其抑制BRAF的IC50分別為38和4.8nM。后續(xù)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造得到酶（IC50=0.3nM）和細(xì)胞（IC50=6nM）抑制活性更佳的化合物6，且動物實(shí)驗(yàn)表明6藥代動力學(xué)性質(zhì)較好，口服有效[6]。

2.1.2 Dabrafenib （GSK-2118436，7）

Dabrafenib是GSK公司開發(fā)的另一個新型口服靶向Type I BRAF抑制劑，已于2013年5月獲FDA批準(zhǔn)用于治療不可切除的或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[7]。臨床發(fā)現(xiàn)，它與Vemurafenib類似，在治療6～7個月后出現(xiàn)耐藥性問題。為了克服耐藥性，GSK和日本Tobacco公司合作開發(fā)Dabrafenib和MEK抑制劑Trametinib的復(fù)方制劑，并于2014年1月上市用于治療BRAFV600E突變的黑色素瘤[8]。

2.1.3三芳基咪唑類化合物 三芳基咪唑類抑制劑是靶向激酶Type I構(gòu)象的經(jīng)典I型抑制劑，它包括一個N雜環(huán)，通常是吡啶或者嘧啶，常與鉸鏈區(qū)Gln530或Cys532發(fā)生氫鍵作用；中心的咪唑環(huán)占據(jù)ATP結(jié)合口袋，環(huán)C取代芳基與變構(gòu)位點(diǎn)相互作用，芳香環(huán)D引入極性基團(tuán)伸向溶劑區(qū)（見圖1），代表化合物SB-590885（8）。據(jù)報道，化合物8對BRAF的Kd值為0.3 nM，可見其酶抑制活性非常高[9]。

圖1 三芳基咪唑類BRAF抑制劑及與BRAF結(jié)合模式

Dan等[10]對8進(jìn)行改造，將C環(huán)的肟改成帶氫鍵供體的吡唑，設(shè)計出化合物9，并以9為先導(dǎo)物進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，將D環(huán)取代基環(huán)合成甲基哌嗪得到活性更加的10，其抑制BRAFV600E的IC50為240 nM。2013年，Dan[11]等又將C環(huán)換成萘酚得到脂溶性和活性更佳的化合物11（抑制BRAF的IC50=9nM）。

2.1.4噻吩類化合物 Xie等[12]利用分子對接和結(jié)構(gòu)虛擬篩選（SBVS）技術(shù)成功從SPECS數(shù)據(jù)庫中篩選到一系列噻吩類BRAFV600E選擇性抑制劑，其中化合物12和13抑制BRAFV600E的IC50達(dá)到微摩爾級，可作為先導(dǎo)物來進(jìn)一步改造。

2.2 II型抑制劑 II型抑制劑與BRAF的Type II構(gòu)象結(jié)合，通過2～5個氫鍵占據(jù)疏水口袋中的變構(gòu)位點(diǎn)。其中最重要的兩個氫鍵分別是與αC-helix中保守的Glu側(cè)鏈形成的氫鍵和與DFG基序中Asp形成的氫鍵。而這個疏水口袋周圍的氨基酸保守性較差，因此II型抑制劑可能具有更好的選擇性。

2.2.1 Sorafenib （BAY 43-9006，14）

Sorafenib是首個成功上市的Raf激酶抑制劑，盡管后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)抗腫瘤活性主要是通過多種受體酪氨酸激酶（RTK），包括VEGFR、PDGFR和kit等抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管的生成；但它作為第一個BRAF抑制劑，臨床前研究表明，它對BRAFWT和BRAFV600E都有很好的激酶抑制活性。蛋白晶體復(fù)合物揭示，Sorafenib與激酶Type II結(jié)合，屬于II型抑制劑，它的吡啶環(huán)上酰胺基與鉸鏈區(qū)Cys531形成氫鍵促使吡啶環(huán)占據(jù)ATP結(jié)合口袋；脲基片段與Glu500和Asp593形成三個氫鍵，穩(wěn)定住BRAF的非活性構(gòu)象；末端的三氟甲基占據(jù)αC helix和DFG基序的末端N殘基構(gòu)成的疏水口袋。通過上述結(jié)合作用Sorafenib使BRAF激酶不能磷酸化，從而抑制激酶活性?；赟orafenib結(jié)構(gòu)柔性較大，后續(xù)研究者采用骨架躍遷來降低分子的柔性。

2.2.2 RAF265（17） Savithri等[13]將Sorafenib的脲基分別與A、B芳環(huán)拼合得到化合物15和16，雖然兩者的BRAF抑制活性略有下降，但理化性質(zhì)和藥代動力學(xué)性質(zhì)都有所提高。因此，以16為先導(dǎo)物進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到活性較好的RAF265（17）。在人類移植瘤研究中，RAF265對BRAFV600E人移植瘤和BRAFWT模型都具有高效性，目前正處于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的二期臨床實(shí)驗(yàn)階段。

2.2.3吡啶并咪唑酮類化合物 Niculescu-Duvaz等[14]將Sorafenib末端酰胺與C環(huán)吡啶駢合成吡啶并咪唑酮，并在A環(huán)中去除4-Cl，加上6-甲氧基得到化合物18。初步活性評價結(jié)果表明，化合物18抑制BRAF激酶的IC50達(dá)到12nM，抑制黑色素瘤生長的 IC50為4.2 μmol·L-1。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化將B環(huán)換成萘環(huán)以占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)旁的親脂性口袋，最后得到酶（IC50=6nM）和細(xì)胞（IC50=0.32μmol·L-1）抑制活性都更佳的化合物19。

2.2.4噻吩并吡啶類化合物 Tang等[15]用4-氨基噻吩并吡啶替換C環(huán)得到化合物20和21，活性篩選顯示其抑制BRAF的IC50分別為9.6和5.1nM，抑制黑色素瘤的 IC50為0.7和0.2μmol·L-1。

3結(jié)論

BRAF抑制劑能靶向性抑制MAPK信號通路中的BRAF激酶，上市藥物有Sorafenib、Vemurafenib和Dabrafenib，臨床用于黑色素瘤的治療。但這些藥物仍面臨諸多挑戰(zhàn)，例如Sorafenib存在靶點(diǎn)特異性不強(qiáng)，BRAF的基因突變造成Vemurafenib和Dabrafenib臨床中都出現(xiàn)耐藥性，因而迫切需要開發(fā)新型特異性耐突變BRAF特別是BRAFV600E抑制劑。借助于BRAF三維晶體結(jié)構(gòu)的解析和計算機(jī)虛擬篩選技術(shù)的進(jìn)步，將會有越來越多結(jié)構(gòu)新穎、特異性強(qiáng)、耐突變的BRAF抑制劑被研究開發(fā)出來，用于黑色素瘤、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等腫瘤疾病治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]Santarpia L，Lippman S M，El-Naggar A K.Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy[J].Expert opinion on therapeutic targets，2012，16：103-119.

[2]Li H-F，Chen Y，Rao S-S，et al. Recent advances in the research and development of B-Raf inhibitors[J]. Current medicinal chemistry，2010，17：1618-1634.

[3]Tsai J，Lee J T，Wang W，et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2008， 105：3041-3046.

[4]Banaszynski M， Kolesar J M. Vemurafenib and ipilimumab： New agents for metastatic melanoma[J]. American Journal of Health-System Pharmacy，2013：70.

[5]Wenglowsky S， Moreno D， Rudolph J， et al. Pyrazolopyridine inhibitors of B-Raf V600E. Part 3： An increase in aqueous solubility via the disruption of crystal packing[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters，2012， 22：912-915.

[6]Wenglowsky S， Ren L， Grina J， et al.Highly potent and selective 3- N-methylquinazoline-4（3H）-one based inhibitors of B-Raf V600E kinase[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters，2014， 24：1923-1927.

[7]Huang T， Karsy M， Zhuge J， et al. B-Raf and the inhibitors： from bench to bedside[J]. J Hematol Oncol，2013， 6：30.

[8]Vella L J， Pasam A， Dimopoulos N， et al. MEK inhibition， alone or in combination with BRAF inhibition， affects multiple functions of isolated normal human lymphocytes and dendritic cells[J]. Cancer Immunology Research，2014，0181.2013.

[9]King A J， Patrick D R， Batorsky R S， et al. Demonstration of a genetic therapeutic index for tumors expressing oncogenic BRAF by the kinase inhibitor SB-590885[J]. Cancer research 2006， 66：11100-11105.

[10]Niculescu-Duvaz D， Niculescu-Duvaz I， Suijkerbuijk B M， et al. Novel tricyclic pyrazole BRAF inhibitors with imidazole or furan central scaffolds[J]. Bioorg Med Chem，2010， 18： 6934-6952.

[11]Niculescu-Duvaz D， Niculescu-Duvaz I， Suijkerbuijk B M， et al. Potent BRAF kinase inhibitors based on 2， 4， 5-trisubstituted imidazole with naphthyl and benzothiophene 4-substituents[J]. Bioorg Med Chem，2013， 21：1284-1304.

[12]Xie Y， Chen X， Qin J， et al. Identification and synthesis of N -（thiophen-2-yl） benzamide derivatives as BRAF V600E inhibitors[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2013， 23：2306-2312.

[13]Ramurthy S， Subramanian S， Aikawa M， et al. Design and synthesis of orally bioavailable benzimidazoles as Raf kinase inhibitors[J]. J Med Chem 2008， 51：7049-7052.

[14]Niculescu-Duvaz D， Gaulon C， Dijkstra H P， et al. Pyridoimidazolones as novel potent inhibitors of v-Raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1 （BRAF）[J]. J Med Chem 2009， 52：2255-2264.

[15]Tang J， Lackey K E， Dickerson S H. The discovery of potent and selective 4-aminothienopyridines as B-Raf kinase inhibitors[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2013，23：66-70.

編輯/申磊