孟艷艷，王 芳，梁 霞，李建宏

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

微囊藻水華附生菌的代謝特征及對微囊藻生長的影響*

孟艷艷，王 芳，梁 霞，李建宏**

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

為研究附生細(xì)菌對藍(lán)藻水華細(xì)胞微環(huán)境的影響，從微囊藻水華中分離出34株藻附生細(xì)菌，研究其產(chǎn)酶能力. 對氮代謝相關(guān)的酶活性測定結(jié)果顯示：其中13株菌具有蛋白酶活性，5株菌具有較強(qiáng)的氨氮脫除能力，1株菌具有強(qiáng)烈的硝酸還原酶活性；4株菌具有較高的堿性磷酸酶活性；11株菌具有產(chǎn)脂酶的活性. 通過菌和藻共同培養(yǎng)的方法，觀察菌對微囊藻生長的影響，結(jié)果顯示，有11株菌表現(xiàn)出較明顯的促藻生長作用，占總篩選菌株總數(shù)的32%；有3株菌表現(xiàn)出較顯著的抑制藻生長的作用，占總篩選菌株總數(shù)的9.9%. 附生菌產(chǎn)酶能力與生長相關(guān)性的分析顯示，促進(jìn)微囊藻生長的附生菌都具有蛋白酶或脂酶活性.

微囊藻；附生菌；藍(lán)藻水華；酶；微環(huán)境

微囊藻水華導(dǎo)致湖泊、水庫等水體水質(zhì)惡化. 盡管氮、磷濃度增加導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化是引起藍(lán)藻水華的主要因素，但關(guān)于微囊藻水華的形成詳細(xì)生態(tài)機(jī)制至今依然所知甚少[1-3]. 在天然水體中，微囊藻細(xì)胞被大量的多糖裹挾以群體的形態(tài)存在[4-5]，其膠被上粘附著大量的細(xì)菌，這些細(xì)菌與藻細(xì)胞構(gòu)成了一個獨(dú)特的微環(huán)境. 由于微囊藻生長繁殖迅速，水華發(fā)生過程伴隨著細(xì)胞的死亡與新生，附生菌的代謝可對水環(huán)境中的營養(yǎng)再生和物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生重要影響，直接或間接地影響水華藍(lán)藻的生長[6-8]. 因此分析微囊藻附生菌的代謝能力對揭示水華形成的微環(huán)境以及微生物種群之間的生態(tài)聯(lián)系意義重大.

已有報道發(fā)現(xiàn)附生的產(chǎn)堿性磷酸酶細(xì)菌有助于微囊藻磷營養(yǎng)的供給[9-12]；也有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳酸酐酶附生菌有助于微囊藻利用無機(jī)碳[13]；對微囊藻附生菌氮代謝的研究發(fā)現(xiàn)硝化細(xì)菌能對銅綠微囊藻產(chǎn)生一定程度的抑制作用[14-15]；同時也有不少研究表明一些溶藻菌能裂解藻細(xì)胞[16-19]. 但這些研究僅是討論單一菌株對微囊藻細(xì)胞的生物效應(yīng)，迄今對天然水華中微囊藻附生菌的總體微生物環(huán)境所知甚少.

微囊藻附生菌可利用藻代謝產(chǎn)生的有機(jī)物進(jìn)行生長繁殖，同時細(xì)菌代謝產(chǎn)生的酶及其自身的代謝過程又可影響藻細(xì)胞的生長，弄清微囊藻細(xì)胞附生菌的產(chǎn)酶能力有助于評價這些菌對藻細(xì)胞微環(huán)境的影響. 氮、磷是影響藍(lán)藻生長最重要的營養(yǎng)元素，細(xì)胞死亡分解后物質(zhì)的再利用也是藻生長的重要營養(yǎng)來源，本文從這兩個方面出發(fā)，研究微囊藻水華中與藻細(xì)胞緊密粘附的附生菌的產(chǎn)酶能力，包括：對不同形態(tài)氮的代謝能力(蛋白酶、硝酸還原酶、脫氨氮能力)、將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷的能力(堿性磷酸酶)以及有機(jī)物分解能力(脂酶)，并通過藻和菌共培養(yǎng)，觀察附生菌對微囊藻生長的影響，以期為揭示藻際微生物環(huán)境對藻生長的影響奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 微囊藻附生菌的分離與培養(yǎng)

于2012年6-7月采集太湖(梅梁灣)、巢湖(十五里河橋)、南京秦淮河(集慶門)以及南京財經(jīng)大學(xué)中心湖中的微囊藻水華樣品，新鮮藻樣以6000 轉(zhuǎn)/min離心5 min后，小心吸取1 ml漂浮的微囊藻群體，轉(zhuǎn)入10 ml滅菌的BG-11培養(yǎng)液中，渦旋振蕩器震蕩洗滌5 min，6000 轉(zhuǎn)/min離心5 min后吸取漂浮藻群體，重復(fù)上述過程3次，以洗去游離細(xì)菌. 最后取漂浮的藻體，加入等體積滅菌的石英砂，用渦旋振蕩器振蕩5～10 min，至顯微鏡檢查群體完全分散，靜置15 min，取上層清液100 μl涂布于LB培養(yǎng)基平板上[20]，恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2 d后，分別挑出菌落形態(tài)不同的菌株，經(jīng)反復(fù)劃線純化后保存?zhèn)溆?

為避免LB培養(yǎng)基中其他有機(jī)成分對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾，后期的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)均采用添加葡萄糖的M9無機(jī)鹽培養(yǎng)基[21]，培養(yǎng)條件為37℃搖床培養(yǎng)12 h. 收獲細(xì)胞時用6000 轉(zhuǎn)/min離心5 min沉淀出細(xì)菌，用無菌生理鹽水重新懸浮沉淀，重復(fù)洗滌菌體沉淀3次，最終用0.9%的生理鹽水調(diào)成菌懸液，菌濃度約為2.0×107cells /ml，用于菌藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

1.2 菌株產(chǎn)酶能力的測定

1.2.1 酪蛋白酶活力的測定 配制酪蛋白瓊脂固體培養(yǎng)基[22]，用滅菌的牙簽挑取菌落，接種到酪蛋白培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察平板顏色變化. 活性大小以透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)表示.

1.2.4 菌株產(chǎn)堿性磷酸酶(ALP)活力的測定 采用96微孔板4-氨基安替比林顯色[25]，酶標(biāo)儀測定每個微孔反應(yīng)液吸光值的方法測定.

1.2.5 菌株產(chǎn)酯酶活力的測定 制備油脂培養(yǎng)基平板[26]. 分別滴加5 μl各個菌株的菌懸液在平板上，在37℃條件下培養(yǎng)12 h，取出平板，觀察各菌株分解脂肪的能力.

1.3 附生菌對微囊藻生長的影響

藻種銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaXW01)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存. 采用BG-11培養(yǎng)基28±2℃、24 h連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)期間震蕩搖勻. 100 ml三角瓶中裝20 ml藻培養(yǎng)液，每瓶加入100 μl的菌懸液(1.1節(jié)中所述的生理鹽水菌懸液)，每個處理設(shè)置3個平行. 于25℃的光照培養(yǎng)室連續(xù)培養(yǎng)7 d，用分光光度計測定藻的生長狀況(OD650).

1.4 菌株的分子鑒定

運(yùn)用16S rRNA基因全序列分析方法對附生菌進(jìn)行鑒定. 菌落PCR擴(kuò)增選用通用引物[27]，PCR產(chǎn)物委托南京思普金生物科技有限公司測序，獲得序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，運(yùn)用MEGA5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，選擇Kimura2-Parameter Distance模型計算進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法建樹(1000次隨機(jī)取樣，bootstrap檢驗(yàn)可靠性).

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件，差異顯著性采用SPSS軟件進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 附生菌的分離培養(yǎng)

從4個不同采樣地點(diǎn)的微囊藻水華樣品中共分離出34株緊密粘附的附生菌，其中從秦淮河樣品中分離獲得14株菌(編號為Q1～Q14)，從南京財經(jīng)大學(xué)中心湖樣品中分離獲得3株菌(編號N-1～N-3)，從巢湖樣品中分離獲得6株菌(編號CH-1～CH-6)，從太湖樣品中獲得11株菌(編號8-1～8-5，E-1～E-2，E2-1～E2-4).

2.2 附生菌與氮代謝相關(guān)的產(chǎn)酶能力

2.2.1 附生菌產(chǎn)酪蛋白酶能力 經(jīng)測定產(chǎn)蛋白酶的菌株共13株，占附生菌總數(shù)的38%(表1). 由此可見，微囊藻附生菌中，有相當(dāng)數(shù)量的蛋白酶產(chǎn)生菌.

表1 附生菌株的酪蛋白酶活力*

* +表示D/d≤2.00；++表示2.004.00； -表示未檢出.

2.2.2 附生菌脫氨氮能力 各菌株脫氨氮能力的測定結(jié)果(圖1)可見，共有31株菌可脫除氨氮，占附生菌總數(shù)的91%，其中氨氮脫除率達(dá)60%以上的菌占9%，氨氮脫除率達(dá)40%以上的菌占18%，氨氮脫除率達(dá)30%以上的菌占38%. 表明總體上附生菌有較強(qiáng)的脫氨氮能力.

對比菌的生長量與氨氮的消除量可見，除8-2、8-4、Q-1、Q-11附生菌外，大多數(shù)具有相對高脫除氨氮能力的菌其菌濃度并不高(如CH-4、CH-5、CH-6、8-1)，表明這些氨氮的脫除并非由于附生菌生長對氮營養(yǎng)的消耗，而是將氨氮轉(zhuǎn)變成其他形態(tài)的氮.

圖1 附生菌的氨氮脫除率Fig.1 Elimination rate of NH3-N of the attached strains

2.2.3 附生菌硝酸還原酶活力 從34株藻附生菌中僅分離得到1株有顯著硝酸還原酶活力的菌(即E-1)，經(jīng)過16S rRNA基因比對表明該菌是弗氏檸檬酸桿菌(與CitrobacterfreundiiJXMR0908L1的相似性為100%).

2.3 附生菌堿性磷酸酶活力

堿性磷酸酶可促進(jìn)有機(jī)態(tài)磷轉(zhuǎn)化為藻類可利用的無機(jī)態(tài)磷. 從34株藻附生菌中分離出4株ALP產(chǎn)生菌，分別為Q-9、8-3、N-1、 CH-5，占附生菌總數(shù)的12%，其中Q-9的ALP活力最高(圖2).

圖2 附生菌株的堿性磷酸酶活力Fig.2 Alkaline phosphatase activities of the attached strains

2.4 附生菌株對脂肪代謝的能力

在34株藻附生菌中，11株具有產(chǎn)胞外脂酶活力，占總附生菌的32%(表2).

2.5 附生菌對銅綠微囊藻生長的影響

在銅綠微囊藻XW01培養(yǎng)物中分別加入34株附生菌，培養(yǎng)7 d后測定藻濃度(圖3)，結(jié)果表明Q-1、Q-2、Q-4、Q-6、Q-8、Q-11、Q-12、Q-14、CH-6、N-2、8-4共11株菌均表現(xiàn)出較明顯的藻生長促進(jìn)作用，占附生菌總數(shù)的32%；顯著抑制藻生長的株菌是8-5、CH-3、N-1，占附生菌總數(shù)的9.9%； 其它20株菌對藻生長無明顯影響.

2.6 菌株分子鑒定

分別對2株顯著抑制微囊藻生長(8-5、CH-3)和2株顯著促進(jìn)微囊藻生長(Q-4、Q-14)的菌進(jìn)行分子鑒定. 通過PCR擴(kuò)增16S rRAN基因并測序，利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似性比對，結(jié)果如表3，與相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4.

3 討論

3.1 附生菌的分離和培養(yǎng)

通常微囊藻水華暴發(fā)的水體中均有較高的細(xì)菌數(shù)量(高達(dá)106CFU/ml)，弄清水體中各種微生物代謝對藻生長的影響是一項艱巨的任務(wù)，因此本研究僅將目標(biāo)聚焦于藻群體中與藻細(xì)胞緊密結(jié)合的附生菌. 本研究采用反復(fù)洗滌、低速離心的方法，洗去與微囊藻群體表面粘附不緊密的細(xì)菌，最終從4個樣品中篩選出34株菌落形態(tài)具有明顯差異的菌株. 由于自然界中大多數(shù)細(xì)菌具有不可培養(yǎng)性，本文篩選培養(yǎng)出的菌株僅是實(shí)際種類的一小部分，但通過這些菌的分析至少可以從一定程度上反映藻周際細(xì)菌環(huán)境狀況.

表2 附生菌的脂酶活力*

* +表示弱脂酶活力；++表示中等強(qiáng)度脂酶活力；+++表示強(qiáng)脂酶活力； -表示未檢出脂酶活力.

圖3 附生菌對銅綠微囊藻XW01生長的影響Fig.3 Effects of the attached strains on the growth of Microcystis aeruginosa XW01

菌株鑒定結(jié)果登錄號最大相似性8-5AcidovoraxdelafieldiiDPS2(徳氏食酸菌)HQ704415.1100%CH-3BacilluscereusstrainHNSQ9(蠟狀芽孢桿菌)JQ821384.1100%Q-4BacillusfirmusstrainKJ-W9(堅固芽孢桿菌)JQ799106.1100%Q-14AeromonasaquariorumstrainKBN1201762(水族箱產(chǎn)氣單胞菌)JX308270.1100%

DGGE法通常是分析環(huán)境中細(xì)菌群落生物多樣性的重要工具，但這一方法并不能測定出細(xì)菌對環(huán)境中物質(zhì)代謝的能力. 本文通過分離純培養(yǎng)方法，可定性或半定量地反映附生細(xì)菌在環(huán)境物質(zhì)循環(huán)中的作用，從另一個角度描繪藻際微生物生態(tài).

圖4 附生菌8-5、CH-3、Q-4和Q-14與相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the attached strains 8-5，CH-3，Q-4，Q-14 and related strains

3.2 微囊藻附生菌的產(chǎn)酶能力及意義

3.2.1 附生菌產(chǎn)氮代謝相關(guān)酶的意義 氮是微囊藻生長必需的重要元素，附生菌對不同形態(tài)氮的代謝必將影響相鄰藻細(xì)胞的生長.

1) 酪蛋白酶活力：在水華大量生長過程中必然伴隨著許多藻細(xì)胞的衰老、死亡，具有產(chǎn)生胞外蛋白酶的附生菌有助于迅速分解死亡細(xì)胞中的蛋白質(zhì)(藍(lán)藻細(xì)胞通常含有超過30%的蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿拥陌被?，使其中的氮素可以迅速被再利? 本研究結(jié)果顯示，38%的附生菌都具有產(chǎn)酪蛋白酶的活力，占有較大比例，也突顯這些附生菌在氮營養(yǎng)循環(huán)中的作用.

2) 氨脫除能力：氨氮是常見的氮形態(tài)之一，低濃度的氨氮通常是藻細(xì)胞最容易利用的氮形態(tài)，但高濃度的氨氮通常對細(xì)胞有一定的毒害. 微囊藻的附生菌中91%的菌株具有消除氨氮的能力，其中又有38%的菌顯示較強(qiáng)的脫氨能力.

細(xì)菌對氨氮的消耗一方面是自身生長需要消耗氮營養(yǎng)，另一方面是將氨氮代謝為其他氮形式(在有氧條件下氧化成亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮).具有較高脫除氨氮能力的菌株，菌的生物量并沒有大量增加，說明這些菌對氨的脫除并非是用于自身的生長(圖1). 從對藻細(xì)胞的影響來看，雖然附生菌對氨氮的消耗會競爭氮營養(yǎng)的供給，但當(dāng)稠密的水華細(xì)胞死亡時，死細(xì)胞分解產(chǎn)生的較高濃度氨氮會對其他藻細(xì)胞產(chǎn)生毒害，這些具有強(qiáng)脫氨能力的附生菌可能有助于保護(hù)藻細(xì)胞避免過高濃度氨氮的毒害.

3) 硝酸還原酶活力：附生菌中硝酸鹽還原菌的數(shù)量很少，本研究中僅有一株菌有較高的硝酸還原酶活力. 硝酸鹽還原菌可將硝酸根還原成亞硝酸鹽并進(jìn)一步還原成氨或氮[28]，這一還原過程主要在厭氧環(huán)境下發(fā)生. 由于微囊藻細(xì)胞多漂浮于水面并可進(jìn)行光合作用，其細(xì)胞周圍總體上是處于有氧環(huán)境，這類菌對硝態(tài)氮的作用不大. 即使當(dāng)微囊藻群體下沉到水底的厭氧環(huán)境中，由于在附生菌中這類菌數(shù)量較少，對硝態(tài)氮代謝的貢獻(xiàn)也有限.

3.2.2 附生菌產(chǎn)磷代謝相關(guān)酶的意義 本文結(jié)果顯示，12%的附生菌具有產(chǎn)胞外ALP的能力. 當(dāng)水體中無機(jī)磷缺乏時，ALP附生菌可以催化有機(jī)磷分解為無機(jī)磷，補(bǔ)充水體磷營養(yǎng)[9，29]. 因此，這些菌的存在無疑有利于微囊藻的生長.

3.2.3 附生菌產(chǎn)脂肪酶的意義 具有產(chǎn)脂肪酶能力的菌株在附生菌中的比例高達(dá)32%，這些菌的脂肪代謝作用對促進(jìn)群體中衰老死亡細(xì)胞的分解，加快物質(zhì)循環(huán)利用有一定的價值. 由于藍(lán)藻細(xì)胞壁的主要成分是脂多糖，因此這些菌的存在可能對細(xì)胞壁的分解代謝產(chǎn)生一定的影響.

3.3 附生菌產(chǎn)酶能力與對藻細(xì)胞生長影響的相關(guān)性

為分析細(xì)菌的生理特征與藻的生長的關(guān)系，將5株顯著促藻生長菌和4株顯著抑藻生長菌的生理特征列于表4.對微囊藻生長有促進(jìn)作用的菌均具有產(chǎn)酪蛋白酶或(和)產(chǎn)脂肪酶活力，這有可能是因?yàn)樵宓纳L過程中一直都伴隨藻細(xì)胞的衰亡和裂解，酪蛋白酶和脂酶會在這個過程中不斷地發(fā)揮著催化水解作用，為藻的生長提供有利條件. 但也有可能是伴隨這些酶產(chǎn)生的過程，附生菌同時也產(chǎn)生一些生長刺激因子促進(jìn)藻生長. 附生菌促藻生長的機(jī)理有待進(jìn)一步的工作進(jìn)行驗(yàn)證.

然而顯著抑制藻生長的4株菌均無顯著的產(chǎn)酶特征，它們對藻生長的抑制可能是產(chǎn)生了某些抑制藻生長的物質(zhì)，而并非胞外酶的作用所導(dǎo)致.

表4 顯著影響微囊藻生長的菌株生理特征*

* +表示弱酶活力；++表示中等強(qiáng)度酶活力；+++表示強(qiáng)酶活力； -表示未檢出酶活力.

在本文的菌-藻共培養(yǎng)研究中，由于采用生長旺盛的藻和營養(yǎng)物充分的培養(yǎng)基(BG-11)，理論上在較短的培養(yǎng)時間內(nèi)細(xì)菌對營養(yǎng)環(huán)境的改變作用不會很大，因此，附生菌的ALP、NR以及脫氨酶的作用可能并未顯現(xiàn)出來，這些產(chǎn)酶菌在自然環(huán)境下對藻生長的影響，需要通過進(jìn)一步模擬自然生態(tài)實(shí)驗(yàn)來確定.

3.3 顯著影響藻細(xì)胞生長的附生菌的多樣性

關(guān)于抑藻菌已有不少研究，席宇等分離出來的一株溶藻菌，鑒定為一種歐文氏菌[30]；崔亞青等從太湖分離到一株強(qiáng)烈的溶藻菌，鑒定該菌株屬于水單胞菌屬[31]；高菲等以巢湖作為采樣點(diǎn)，分離得到2株溶藻菌，經(jīng)分子鑒定為約氏不動桿菌和門多薩假單胞菌[32]. 而本文得到的藻生長抑制菌8-5、CH-3分別為徳氏食酸菌、蠟狀芽孢桿菌屬，不同于已報道的種類，顯示微囊藻水華環(huán)境中抑藻菌具有豐富的多樣性.

2株對微囊藻生長有促進(jìn)作用的菌分屬于芽孢桿菌屬(Q-4，產(chǎn)脂肪酶)和產(chǎn)氣單胞菌屬(Q-14，產(chǎn)酪蛋白酶)，也顯示促生長類群的多樣性.

3.4 結(jié)語

通過附生菌代謝特性的分析，定性地給出各菌的代謝特征，推測其在改變微囊藻微環(huán)境中的作用. 總體來看，附生菌中較多的菌株具有分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，與藻細(xì)胞形成“生產(chǎn)者-分解者”密切相連的微環(huán)境，這種緊密相連的關(guān)系在自然生態(tài)環(huán)境中理應(yīng)是對微囊藻有益的. 但是，由于各種微生物具有復(fù)雜的代謝特征，很難通過單一的代謝能力去評價其在自然環(huán)境中的全面作用，特別是本文僅通過定性的方法(單一菌株純培養(yǎng))觀察菌-藻的關(guān)系，而并未考慮自然環(huán)境中不同菌的豐度以及不同環(huán)境對菌代謝的影響，因此，有待通過進(jìn)一步的大量研究，揭示微囊藻細(xì)胞周際的微生物對藍(lán)藻水華的作用.

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Metabolic characteristics and effects onMicrocystisgrowth of attached bacteria ofMicrocystisblooms

MENG Yanyan，WANG Fang， LIANG Xia & LI Jianhong

(LifeSciencesCollege，NanjingNormalUniversity，Nanjing210023，P.R.China)

To study the effects of attached bacteria on the microenvironment ofMicrocystiscells of blooms， thirty-four attached bacterial strains were isolated fromMicrocystiscolonies sampled from 4 different bloom samples， and enzyme-producing abilities of the isolated strains were measured. Measuring of nitrogen metabolism enzymes showed that 13 strains could hydrolyze casein， 5 strains could effectively remove ammonia， and 1 strain had a strong nitrate reductase activity. Measuring of phosphorus metabolism enzymes displayed 4 strains with phosphates’ activity. The measurement also showed 11 strains with esterase activity. To evaluate the effects of the bacterial strains on the growth ofMicrocystis， each isolated strain was co-cultured withMicrocystis. The results showed that 11 strains could obviously promoteMicrocystisgrowth，took up 32% of the total isolates； three strains obviously inhibited the growth， took up 9.9% of the total isolates. Relationship of enzyme production ability and effects onMicrocystisgrowth revealed that the growth-promoting strains were case in aseor esterase-producing strains.

Microcystis； attached bacteria； cyanobacterial bloom； enzyme； microenvironment

J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2015， 27(6)： 1115-1123

DOI 10.18307/2015.0617

?2015 byJournalofLakeSciences

*國家自然科學(xué)基金項目(31370217)、國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目(J1103507)和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目聯(lián)合資助.

2014-11-10收稿；2015-03-30收修改稿.

孟艷艷(1986～)，女，碩士研究生；E-mail：mengyanyan0828@126.com.

**通信作者；E-mail：lijianhong@njnu.edu.cn.