朱丹 蔡可英 曹萌 劉超

胰島素原穩(wěn)態(tài)與胰島β細胞功能

朱丹 蔡可英 曹萌 劉超

胰島β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有大量新合成的胰島素及胰島素前體即胰島素原，胰島素原經(jīng)過正確的處理轉(zhuǎn)換為天然折疊單體形式即有活性的胰島素原，后者經(jīng)過剪切去除C肽而形成胰島素，從而發(fā)揮生物學效應。未折疊或者錯誤折疊的胰島素原則仍以非天然折疊多肽的形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。任何原因?qū)е碌囊葝u素原折疊率的改變均會導致胰島素原穩(wěn)態(tài)失衡,導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和胰島β細胞的功能改變。

胰島素原；胰島β細胞；糖尿?。灰葝u素原穩(wěn)態(tài)

眾所周知，2型糖尿病發(fā)病的重要機制是胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病發(fā)病之前就有胰島素抵抗的長期存在。但并不是所有胰島素抵抗均會發(fā)展為糖尿病，因為此時的胰島β細胞還可以產(chǎn)生過量的胰島素來代償胰島素抵抗狀態(tài)，遺傳缺陷、缺氧、氧化應激、細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變等均可擾亂胰島素的合成和分泌過程，抑制胰島素基因的表達，促進胰島β細胞的凋亡等，進而導致2型糖尿病的發(fā)生[1]。可見，胰島β細胞功能衰竭是糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。

1 胰島素原合成及胰島素原穩(wěn)態(tài)（PIHO）

正常條件下，前胰島素原在信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號系統(tǒng)相互作用，被協(xié)同轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的前胰島素原的信號肽被裂解后形成胰島素原，新合成的胰島素原必須在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊才能轉(zhuǎn)運至高爾基體被包裹成分泌顆粒，進而在其中轉(zhuǎn)化為有生物活性的胰島素[2]。任何原因?qū)е碌囊葝u素原錯誤折疊均可使之在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS），最終導致胰島β細胞功能失調(diào)[3]。PIHO失衡是指胰島β細胞內(nèi)胰島素原天然折疊單體與非天然折疊多肽比例失調(diào)所致胰島素釋放異常、胰島β細胞功能衰竭[4]。

胰島素原在轉(zhuǎn)換為胰島素的過程中，通過正確折疊形成天然胰島素單體，是形成胰島素雙鏈結(jié)構的先決條件。但是若錯誤折疊，則形成的胰島素原由于空間結(jié)構不穩(wěn)定，無法組裝成有活性的胰島素[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素原天然折疊率在糖尿病的發(fā)病中起重要作用。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)，正常小鼠胰島β細胞內(nèi)胰島素原的天然折疊單體約占70%，非天然折疊多肽占30%，而糖尿病小鼠胰島β細胞內(nèi)胰島素原的天然折疊單體僅占10%，非天然折疊多肽占90%。說明胰島素原折疊率決定了胰島素釋放的效率，胰島素原的自身成熟及轉(zhuǎn)化可能是一個動態(tài)的平衡。

正常條件下，胰島β細胞會形成少量錯誤折疊的胰島素原。這些胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊相關蛋白或分子伴侶的幫助下，可再折疊成空間構型正常的胰島素原，而不能再次正確折疊的胰島素原則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解系統(tǒng)被降解。因此，少量錯誤折疊的蛋白質(zhì)并不影響正常胰島β細胞的功能[6]。即在正常條件下，胰島素原的折疊率是可以保持在正常范圍內(nèi)的，被稱為PIHO[7]。持久或劇烈的ERS會引起胰島β細胞功能失調(diào)，導致細胞凋亡[8]。

2 PIHO失衡的發(fā)現(xiàn)

在體外生物工程制造胰島素類似物治療糖尿病時，首次發(fā)現(xiàn)了異常的胰島素原二硫化物異構體，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在生理條件下β細胞會形成少量錯誤折疊的胰島素原[9-10]。在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊相關酶及分子伴侶的幫助下，錯誤折疊的胰島素原可再折疊形成正常的空間構型，而不能再次正確折疊者，將被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解系統(tǒng)降解。進一步研究發(fā)現(xiàn)其原因為胰島素原二硫鍵不能正確配對，導致胰島素原不能正確折疊生成有活性的胰島素原，使異常且錯誤折疊的胰島素原增多[11]。單胰島素基因C（A7）Y突變的糖尿病小鼠即Akita小鼠模型已廣泛用于對糖尿病的研究，其特征是胰島β細胞明顯受損而不伴有胰島素抵抗[12]。通過對Akita小鼠的研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在胰島素原失衡。Yuan等[13]對Akita鼠及相關的胰島細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平未見明顯異常，而在翻譯后加工過程發(fā)現(xiàn)錯誤折疊的胰島素原堆積、胰島素分泌明顯減少。這一現(xiàn)象在非肥胖小鼠模型中也同樣存在，提示胰島素原形成胰島素的過程存在異常，錯誤折疊的胰島素原滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不能被轉(zhuǎn)運至高爾基體及下游的分泌通路，胰島素合成減少并激活ERS，誘導β細胞凋亡。

現(xiàn)有資料表明，PIHO失衡對胰島β細胞的影響主要有兩個方面。首先，它可以導致胰島β細胞的結(jié)構發(fā)生改變。在電子顯微鏡下，與正常小鼠胰島β細胞相比，Akita小鼠胰島β細胞成熟胰島素顆粒明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及線粒體不同程度擴張，溶酶體數(shù)量增多[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，Akita小鼠胰島β細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些類似豆莢樣的結(jié)構，猜測可能是未成熟的胰島素顆粒[13]。其次，它可以導致胰島β細胞發(fā)生ERS。研究顯示，Akita鼠體內(nèi)ERS標志物如轉(zhuǎn)錄活化因子6、X-結(jié)合蛋白1的表達明顯增加[15]。ERS誘導的CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）表達增加，可誘導胰島β細胞凋亡，促進Akita小鼠糖尿病的發(fā)生，而敲除CHOP基因的小鼠，ERS誘導的β細胞凋亡減少，糖尿病的發(fā)生延遲[16]。以上研究均說明Akita鼠發(fā)生糖尿病主要是由于錯誤折疊或未折疊的胰島素原堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導致PIHO失衡，進而引起ERS，導致β細胞凋亡。

3 PIHO的機制

3.1 胰島素原過度合成導致PIHO失衡 有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病發(fā)生之前，胰島素抵抗已長期存在，為了代償其所引起的胰島素分泌相對不足，胰島β細胞代償性合成超過其折疊能力的胰島素原，致使錯誤折疊或未折疊的胰島素原顯著增加[17]。對Akita小鼠β細胞中胰島素原合成、折疊及轉(zhuǎn)運過程的研究發(fā)現(xiàn)，盡管β細胞分泌的胰島素的量明顯減少，但新合成的胰島素原的量并未減少（包括正確折疊和錯誤折疊的胰島素原）[18]。細胞中錯誤折疊的胰島素原增多，其可能是突變的胰島素基因與未突變的基因相互作用，影響胰島素原的正確合成和折疊，并阻斷其轉(zhuǎn)運、加工及分泌，進一步加重胰島素的缺乏。其具體的分子機制尚須更深入的研究。但胰島素原天然折疊率的比例發(fā)生改變，誘導了PIHO失衡。

3.2 胰島素合成相關的基因突變導致PIHO失衡正常小鼠體內(nèi)有2對有功能、不等位的胰島素基因即INS1和INS2。來自胰島素基因敲除的研究證實，小鼠擁有一半以上的正常胰島素基因就可避免發(fā)生糖尿病[19]。Akita小鼠有4條胰島素合成相關的基因，其中1條基因INS2發(fā)生突變時，動物實驗已證實其不影響INS1、INS2的轉(zhuǎn)錄水平，理論上胰島β細胞功能尚可維持。然而，進一步對Akita小鼠的研究卻發(fā)現(xiàn)，3.5到4周齡時小鼠就發(fā)生了嚴重的胰島素缺乏[14，20]。這提示胰島素基因突變的毒性作用被放大了，其發(fā)病病因并非由于喪失了1條正常的胰島素基因，可能還有其他機制存在。通過對Akita小鼠的進一步研究發(fā)現(xiàn)，INS2基因突變導致胰島素第96位表達半胱氨酸的基因被酪氨酸取代，胰島素A鏈、B鏈之間的二硫鍵形成受阻，無法形成穩(wěn)定的三級結(jié)構，導致錯誤折疊的胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，引發(fā)持續(xù)的ERS，最終引起胰島β細胞功能失調(diào)[21]。

目前研究證實，很多與糖尿病有關的胰島素基因突變都是通過引發(fā)胰島素原的錯誤折疊導致ERS，使胰島素合成減少。其中一些胰島素基因突變是通過改變胰島素原肽鏈上的半胱氨酸的數(shù)量，導致半胱氨酸殘基變成奇數(shù)，破壞胰島素原分子內(nèi)部二硫鍵的正確形成，或因游離的半胱氨酸與未突變的胰島素原分子上的二硫鍵異常配對，導致胰島素原的錯誤折疊，進而引發(fā)ERS[22]。

3.3 分子伴侶表達量的改變導致PIHO失衡 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，前胰島素原被裂解成信號肽和胰島素原，后者在分子伴侶的幫助下正確折疊，繼而轉(zhuǎn)運至高爾基體，進入未成熟的分泌顆粒。在未成熟的顆粒中胰島素原在蛋白水解酶的作用下除去C肽生成成熟的胰島素并儲存在成熟的分泌微粒中。

G蛋白耦聯(lián)受體（GRP）78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶之一，其利用ATP水解的能量加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊并阻止其堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。正常生理條件下，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3個跨膜蛋白（蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇激酶1活化轉(zhuǎn)錄因子6）結(jié)合形成復合物使它們不能被磷酸化活化，處于非激活狀態(tài)[23]。這3個跨膜蛋白已被確定為ERS的感應蛋白，其磷酸化后可誘發(fā)ERS。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊的胰島素原增多時，其首先與GRP78結(jié)合，競爭性干擾GRP78與3個跨膜蛋白結(jié)合，進而促進跨膜蛋白的解離釋放并通過一系列反應發(fā)生磷酸化活化，誘發(fā)ERS[24]。ERS是細胞的一種保護性機制，適度的ERS可使細胞在外界刺激下恢復穩(wěn)定，維持生存，但持續(xù)的ERS可導致胰島細胞凋亡[25]。

GRP78一方面通過參與未折疊蛋白的正確折疊、修飾來保護細胞，另一方面還可以與鈣離子結(jié)合保持鈣離子平衡以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[26]。正常組織中，GRP78的表達水平較低，在缺血、缺氧、鈣離子失衡等應激環(huán)境下，其表達明顯增加，協(xié)助蛋白質(zhì)進行重新裝配和跨膜轉(zhuǎn)運，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，保護細胞。但當持續(xù)或嚴重的ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡不能恢復時，細胞將啟動與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的凋亡程序。所以，GRP78的表達量反映了細胞損傷情況和應激能力，對決定細胞的生存狀態(tài)有重要的作用。對鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在誘導初期，GRP78的表達量增加，以保護細胞，隨著誘導時間的延長，GRP78的表達量明顯下降，未折疊及錯誤折疊的胰島素原增多[27]。除GRP78外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶P58也參與了蛋白質(zhì)的折疊。敲除P58基因的小鼠，其胰島β細胞功能的紊亂，胰島素分泌減少[28]。

綜上所述，PIHO失衡導致嚴重的ERS、葡萄糖刺激的胰島素分泌減少以及胰島β細胞存活率降低。因此，任何原因?qū)е碌腜IHO失衡均可能引起胰島β細胞功能失調(diào)、血糖調(diào)節(jié)受損，從而引發(fā)糖尿病的發(fā)生。通過對PIHO的研究，可以發(fā)現(xiàn)治療糖尿病的新靶點，為臨床盡早診斷和治療糖尿病提供了一個新的思路，值得深入研究。但目前對于胰島素原的研究都是基于鼠源性胰島β細胞，其與人胰島β細胞在形態(tài)及功能等方面具有很大區(qū)別，因此，鼠源性胰島β細胞并不是研究人類糖尿病發(fā)病機制的理想模型，故需要開展基于人胰島β細胞平臺的研究。

［1］Reaven GM.Relationships among insulin resistance，type 2 diabetes，essentialhypertension，and cardiovasculardisease：similarities and differences[J].J Clin Hypertens（Greenwich），2011，13（4）：238-243.

［2］Weiss MA.Proinsulin and the genetics of diabetes mellitus[J].J Boil Chem，2009，284（29）：19159-19163.

［3］Gidalevitz T，Prahlad V，Morimoto RI.The stress of protein misfolding：from single cells to multicellular organisms[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2011，3（6）：a009704.

［4］Wang J，Chen Y，Yuan X，et al.Control of precursor maturation and disposal is an early regulative mechanism in the normal insulin production of pancreatic β-cells[J].PLoS One，2011，6（4）：e19446.

［5］Mahler HC，F(xiàn)riess W，Grauschopf U，et al.Protein aggregation：pathways，induction factors and analysis[J].J Pharm Sci，2009，98（9）：2909-2934.

［6］Liu M，Li YL，Cavener D，et al.Proinsulin disulfide maturation and misfolding in the endoplasmic reticulum[J].J BiolChem，2005，280（14）：13209-13212.

［7］Zhang XP，Yuan QX，Tang W，et al.Substrate-favored lysosomal and proteasomal pathways participate in the normal balance control of insulin precursor maturation and disposal in betacells[J].PLoS One，2011，6（11）：e27647.

［8］Eizirik DL，Miani M，Cardozo AK.Signalling danger：endoplasmic reticulum stress and the unfolded proteinresponse in pancreatic islet inflammation[J].Diabetologia，2013，56（2）：234-241.

［9］Zhang BY，Liu M，Arvan P.Behavior in the eukaryotic secretory pathway of insulin-containing fusion proteins and single-chain insulins bearing various B-chain mutations[J].J Boil Chem，2003，278（6）：3687-3693.

［10］Liu M，Li Y，Cavener D，et al.Proinsulin disulfide maturation and misfolding in the endoplasmic reticulum[J].J Biol Chem，2005，280（14）：13209-13212.

［11］Liu M，Ramos-Castaneda J，Arvan P.Role of the connecting peptide in insulin biosynthesis[J].J Boil Chem，2003，278（17）：14798-14805.

［12］Basu R，Oudit GY，Wang XH，et al.Type 1 diabetic cardiomyopathy in the Akita（Ins2（WT/C96Y））mouse model is characterized by lipotoxicity and diastolic dysfunction with preserved systolic function[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（6）：H2096-H2108.

［13］Yuan QX，Tang W，Zhang XP，et al.Proinsulin atypical maturation and disposal induces extensive defects in mouse Ins2（+/akita）beta-cells[J].PLoS One，2012，7（4）：e35098.

［14］Rajan S，Eames SC，Park SY，et al.In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（3）：E403-E410.

［15］Oyadomari S，Koizumi A，Takeda K，et al.Targeted disruption of the Chop gene delays endoplasmic reticulum stress-mediated diabetes[J].J Clin Invest，2002，109（4）：525-532.

［16］Sou SN，Ilieva KM，Polizzi KM.Binding of human BiP to the ER stress transducers IRE1 and PERK requires ATP[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，420（2）：473-478.

［17］Laybutt R，Preston A，Akerfeldt M，et al.Endoplasmic reticulum stress contributes to beta-cell apoptosis in type 2 diabetes[J].Diabetologia，2006，55（1）：A58.

［18］Liu M，Hodish I，Rhodes CJ，et al.Proinsulin maturation，misfolding，and proteo-toxicity[J].Proc Nat Acad Sci U S A，2007，104（40）：15841-15846.

［19］Babaya N，Nakayama M，Moriyama H，et al.A new model of insulin-deficient diabetes：male NOD mice with a single copy of Ins1 and no Ins2[J].Diabetologia，2006，49（6）：1222-1228.

［20］Leroux L.Compensatory responses in mice carrying a null mutation for Ins1 or Ins2[J].Diabetes，2001，50（90001）：S150-S153.

［21］Araki E，Oyadomari S，Mori M.Impact of endoplasmic reticulum stress pathway on pancreatic beta-cells and diabetes mellitus[J].Exp Biol Med（May-wood），2003，228（10）：1213-1217.

［22］Mori K.Tripartite management of unfolded protein in the endoplasmic reticulum[J].Cell，2000，101（5）：451-454.

［23］Harding HP，Zhang YH，Bertolotti A，et al.Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response[J].Mol Cell，2000，5（5）：897-904.

［24］BertolottiA，ZhangYH，HendershotLM，etal.Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfoldedprotein response[J].Nat Cell Biol，2000，2（6）：326-332.

［25］Biden TJ，Boslem E，Chu KY，et al.Lipotoxic endoplasmic reticulum stress，beta cell failure，and type 2 diabetes mellitus[J].Trends Endocrinol Metab，2014，25（8）：389-398.

［26］Teodoro-Morrison T，Schuiki I，Zhang L，et al.GRP78 overproduction in pancreatic beta cells protects against high-fat-dietinduced diabetes in mice[J].Diabetologia，2013，56（5）：1057-1067.

［27］Yamagishi N，Ueda T，Mori A，et al.Decreased expression of endoplasmic reticulum chaperone GRP78 in liver of diabetic mice[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，417（1）：364-370.

［28］Ladiges WC，Knoblaugh SE，Morton JF，et al.Pancreatic betacell failure and diabetes in mice with a deletion mutation of the endoplasmic reticulum molecular chaperone gene P58（IPK）[J].Diabetes，2005，54（4）：1074-1081.

Proinsulin homeostasis and islet β cell function

Zhu Dan*，Cai Keying，Cao Meng，Liu Chao.*Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China

Cai Keying，Email：caikeying@medmail.com.cn

There is a large number of newly synthetic insulin and proinsulin in endoplasmic reticulum of islet β cells.If correctly folded，proinsulin can be converted into native folded monomeric proinsulin with activity.Unfolded ormisfolded non-nativeformofproinsulin willbe preserved in the endoplasmic reticulum as the folded polypeptide.Changes of proinsulin folding rate caused by any reasons will result in the imbalance ofproinsulin homeostasis，endoplasmic reticulumstress and islet β cells dysfunction.

Proinsulin；Islet β cell；Diabetes mellitus；Proinsulin homeostasis

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：110-113）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.02.010

221004 徐州醫(yī)學院（朱丹）；221006 徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（蔡可英）；210028 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病院區(qū)（曹萌，劉超）

蔡可英，Email:caikeying@medmail.com.cn

2014-11-16）