任國梅 任壽安

間歇低氧對大鼠肝臟GSK-3及mTOR表達的影響

任國梅 任壽安

目的 測定間歇低氧大鼠肝臟糖原合成酶激酶-3（GSK-3）及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達，觀察間歇低氧對胰島素信號轉(zhuǎn)導通路的影響。方法 將24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機數(shù)字表法分成間歇空氣組（NC組）、間歇低氧4周組（IH4組）、間歇低氧8周組（IH8組），每組8只。于上午9:00至下午5:00將IH4組及IH8組暴露于間歇低氧艙內(nèi)，NC組則給予間歇壓縮空氣。檢測各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素（FINS），并以穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素敏感指數(shù)（HOMA-IS）及穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）評價胰島素抵抗；免疫組化法測定大鼠肝臟GSK-3及mTOR的表達，以平均灰度值評價二者的蛋白表達量。結(jié)果 與NC組相比，IH4組、IH8組HOMA-IS降低，空腹血糖、FINS、HOMA-IR升高，以IH8組更為顯著（F值分別為62.52，100.37，68.90，85.49，P均＜0.01）；與NC組相比，IH4組、IH8組GSK-3及mTOR蛋白表達均升高，以IH8組更明顯（F值分別為72.25，148.01，P均＜0.01）。Pearson相關分析顯示GSK-3、mTOR平均灰度值與HOMA-IS呈正相關（r=0.786，0.811，P均＜0.01），與 HOMA-IR 呈負相關（r=-0.882，-0.889，P均＜0.01）。結(jié)論 間歇低氧暴露使大鼠肝臟GSK-3、mTOR表達增加，從而引起胰島素抵抗。

間歇低氧；胰島素抵抗；糖原合成酶激酶-3；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種以睡眠中頻繁發(fā)生呼吸氣流減少或中斷為特征的睡眠呼吸障礙，可誘發(fā)嚴重的睡眠結(jié)構紊亂，造成全身多器官、多系統(tǒng)的損傷。OSAHS并發(fā)糖尿病的關鍵在于胰島素抵抗（IR），且IR隨著OSAHS程度的加重而加重[1]。間歇低氧是OSAHS最顯著的特征，而間歇低氧可致IR，具體機制尚待研究。胰島素信號通路的信號減弱或通路受損是IR形成的必要條件，受體后缺陷是絕大多數(shù)IR的發(fā)生機制，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（PKB/Akt）通路為胰島素受體后主要的信號轉(zhuǎn)導通路，該通路異?？芍翴R[2]。糖原合成酶激酶-3（GSK-3）及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）為該通路重要的負反饋作用蛋白。本實驗建立間歇低氧大鼠模型，模擬OSAHS患者的夜間低氧/復氧過程，并選擇GSK-3、mTOR為研究靶點，探討間歇低氧導致IR的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只，平均體重（170±10）g，按照隨機數(shù)字表法分為間歇空氣組（NC組）、間歇低氧4周組（IH4組）、間歇低氧8周組（IH8組），每組8只，標記。實驗動物、飼料、墊料均由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸科實驗室。實驗室許可證號：SYXK（晉）2009-0004；動物批號：SCXK（晉）2009-0001。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，濕度（50±5）%，室溫（23±2）℃。

1.2 間歇低氧大鼠模型制備 間歇低氧艙制備：體積65 cm×45 cm×50 cm，厚5 mm的透明有機密封玻璃箱，艙蓋密封，艙兩側(cè)各有2個出氣孔以保持艙內(nèi)氣壓恒定。由尼龍抗壓力管連接氧氣鋼瓶、氮氣鋼瓶、單向電磁閥門（該控制系統(tǒng)由單片機編制程序控制）及進氣口?？刂葡到y(tǒng)程序設定：先輸?shù)獨?5 s，使艙內(nèi)氧濃度由21%逐漸降至最低氧濃度7%，持續(xù)10 s后再通氧氣45 s，使艙內(nèi)濃度逐漸恢復至21%后再持續(xù)10 s，每個循環(huán)110 s。艙內(nèi)氧濃度由間歇低氧儀控制，同時由便攜式測氧儀實時監(jiān)控，由生石灰吸收艙內(nèi)水分及CO2。暴露方案：將IH4組與IH8組大鼠每日上午9:00至下午5:00（共8 h）暴露于間歇低氧艙內(nèi)；NC組大鼠給予間歇壓縮空氣，其余條件同實驗組。

1.3 標本采集 于第4、8周間歇低氧暴露結(jié)束后將3組大鼠稱重、腹腔注射10%水合氯醛麻醉、固定、暴露腹主動脈、采血、靜置、高速離心，取上清液于-80℃超低溫冰箱保存以備檢測血清胰島素。取部分肝組織浸泡于4%中性甲醛溶液，48 h后石蠟包埋、切片、染色。

1.4 指標檢測

1.4.1 生理生化指標 間歇低氧暴露結(jié)束后測定3組大鼠空腹血糖、空腹胰島素（FINS）。取大鼠微量尾尖血滴于美國強生公司AW06336402B血糖儀配套試紙上，讀取血糖值。采用125I胰島素放射免疫分析藥盒、全自動放射免疫分析儀檢測血清胰島素水平。計算穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（空腹血糖×FINS）/22.5，計算穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素敏感指數(shù)（HOMA-IS）=1/（空腹血糖×FINS）。

1.4.2 免疫組化法測定大鼠肝臟GSK-3、mTOR的表達 采用石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟，兔抗鼠GSK-3一抗稀釋度為1∶100，兔抗鼠mTOR一抗稀釋度為1∶150，加入一抗后4℃過夜，孵育；生物素標記二抗，DAB顯色，封片，Olympus顯微鏡下觀察切片。用PBS代替一抗陰性對照，用已知陽性片作陽性對照，陽性染色為棕黃色。在光鏡下（400×）對免疫組化切片采圖，采用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)進行灰度定量分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 檢測結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用最小顯著性差（LSD）法，兩變量間的相關分析用Pearson線性相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖、FINS、HOMA-IS、HOMAIR的結(jié)果 與NC組相比，IH4組、IH8組的空腹血糖、FINS及HOMA-IR升高、ISI降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），以IH8組更為顯著（P＜0.01），見表1。

表1 各組空腹血糖、FINS、HOMA-IS、HOMA-IR結(jié)果比較（±s）

表1 各組空腹血糖、FINS、HOMA-IS、HOMA-IR結(jié)果比較（±s）

注：與 NC組相比，aP＜0.01；與 IH4 組相比，bP＜0.01；FINS：空腹胰島素；HOMA-IS：穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素敏感指數(shù)；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)；NC組：間歇空氣組；IH4組：間歇低氧4周組；IH8組：間歇低氧8周組

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2.2 各組大鼠GSK-3、mTOR蛋白的表達 GSK-3蛋白主要在大鼠肝細胞核內(nèi)表達，核內(nèi)呈棕黃色，而細胞質(zhì)中也有少量散在分布的棕黃色顆粒表達；mTOR蛋白主要在大鼠肝細胞胞質(zhì)中表達，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒呈散在分布，細胞核內(nèi)幾乎沒有表達。圖像定量分析顯示：與NC組相比，IH4組和IH8組肝細胞中GSK-3蛋白、mTOR平均灰度值降低，蛋白表達水平升高，差異均有顯著性（P均＜0.01），與IH8組相比，IH4組表達亦升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1（封 3），表2。

表2 各組GSK-3及mTOR蛋白平均灰度值比較（±s）

表2 各組GSK-3及mTOR蛋白平均灰度值比較（±s）

注：與 NC組相比，aP＜0.01；與 IH4 組相比，bP＜0.01；GSK-3：糖原合成酶激酶-3；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；NC組：間歇空氣組；IH4組：間歇低氧4周組；IH8組：間歇低氧8周組

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2.3 HOMA-IS、HOMA-IR與 GSK-3及mTOR相關性分析 GSK-3、mTOR平均灰度值與HOMA-IS呈正相關（r=0.786，0.811，P均＜0.01），與HOMA-IR 呈負相關（r=-0.882，-0.889，P均＜0.01）。

3 討論

OSAHS與糖尿病及IR聯(lián)系緊密，兩者無論是在流行病學、發(fā)病機制還是臨床方面均相關[3]。OSAHS患者存在IR，并隨OSAHS病情的加重更加明顯，另外，IR者OSAHS高發(fā)[4]。OSAHS反復出現(xiàn)的呼吸暫停和低通氣可致一種特殊的缺氧狀態(tài)，即低氧/復氧交替、低氧程度重、血氧變化大、機體難適應、發(fā)生頻率高等特點的間歇低氧。與持續(xù)低氧明顯不同的是間歇低氧存在低氧后復氧，復氧時產(chǎn)生大量的活性氧簇，引發(fā)細胞、分子損傷，臨床表現(xiàn)為全身多系統(tǒng)損害，包括IR或糖尿病，但目前具體機制未明，其中包括影響胰島素信號轉(zhuǎn)導通路中多種蛋白激酶或磷酸酶活性，阻斷胰島素信號轉(zhuǎn)導。Chen等[5]將雄性Sprague-Dawley大鼠分為正常對照組、間歇低氧組和持續(xù)低氧組，給予相應干預40 d，用正常血糖高胰島素鉗夾技術檢測胰島素敏感性，結(jié)果顯示與其他兩組相比，間歇低氧組大鼠的外周血胰島素水平較高，而葡萄糖注射速率明顯降低。Polak等[6]將C57BL/6J小鼠分為正常對照組、間歇低氧組、間歇低氧-復氧組，結(jié)果顯示間歇低氧組空腹血糖、FINS水平及糖耐量高于正常對照組，間歇低氧降低了胰島素敏感性，損傷了β細胞功能，升高了肝糖原含量及肝糖輸出量。本實驗發(fā)現(xiàn)間歇低氧暴露后實驗組HOMA-IS降低，空腹血糖、FINS、HOMA-IR升高，以IH8組更顯著，差異均有統(tǒng)計學意義，說明間歇低氧可致大鼠IR，且IR程度隨暴露時間延長而加重，這與上述實驗結(jié)論相符。

IR是糖尿病的始發(fā)因素，而肝IR是機體IR的核心，因為肝臟是物質(zhì)代謝中心，是葡萄糖代謝及胰島素作用的主要器官，也是人體胰島素受體最密集的臟器之一，對胰島素極為敏感。對小鼠而言，肝臟中的糖代謝對IR起更重要的作用[7]。IR本質(zhì)即胰島素信號轉(zhuǎn)導缺陷，且以受體后的信號抑制最常見。PI3K/Akt通路是胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導的主要途徑，該通路信號轉(zhuǎn)導的減弱或中斷是發(fā)生IR的主因。GSK-3及mTOR均是該通路下游的效應蛋白，可負反饋調(diào)節(jié)該通路，參與了IR的發(fā)生、發(fā)展。

GSK-3分為GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，其磷酸化水平影響自身活性，該激酶磷酸化后失活，去磷酸化后有活性，是調(diào)節(jié)糖原合成的關鍵酶。在胰島素信號通路中，胰島素信號磷酸化GSK-3，使之失活，引起糖原合成酶去磷酸化，降低血糖。發(fā)生IR時，GSK-3活性顯著升高，再磷酸化肝糖原合成酶使之失活，抑制糖原合成及葡萄糖轉(zhuǎn)運，升高血糖。MacAulay等[8]將禁食葡萄糖的小鼠GSK-3α基因敲除后，肝糖原合成增多，肝臟胰島素受體底物（IRS）-1表達顯著增加，胰島素靶組織的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性增強。Greene等[9]發(fā)現(xiàn)GSK-3β通過提高IRS-1、IRS-2的絲/蘇氨酸磷酸化水平抑制胰島素受體對IRS-1、IRS-2的酪氨酸磷酸化，從而阻斷胰島素信號轉(zhuǎn)導，引起IR。這些研究均支持GSK-3為PI3K/Akt通路及糖原合成酶的負反饋調(diào)節(jié)因子。本實驗顯示，IH4組及IH8組大鼠肝細胞GSK-3蛋白表達比NC組明顯增加，且IH8組更為顯著，表明間歇低氧條件下GSK-3在大鼠肝細胞中表達升高，暴露時間延長后表達更明顯。相關性分析顯示GSK-3蛋白平均灰度值與HOMA-IS呈正相關、與HOMA-IR呈負相關，說明間歇低氧使GSK-3蛋白表達增加、發(fā)生IR，且隨暴露時間延長IR程度加重。

mTOR由mTORC1和mTORC2組成，前者位于Akt下游，能被磷酸化的Akt激活；而后者作為一種蛋白激酶-2，將Akt完全活化[10]。胰島素與其受體結(jié)合后啟動IRS-1酪氨酸磷酸化，激活PI3K引起PKB/Akt磷酸化，再激活mTOR并磷酸化其下游底物，從而影響細胞的生長與代謝[11-12]。mTOR及其下游底物核糖體蛋白S6激酶1高度活化后可增加IRS-1的636和639位絲氨酸殘基磷酸化及IRS-1降解和轉(zhuǎn)錄抑制，負反饋阻斷PI3K通路，引起IR[13]。發(fā)生IR時，高度活化的mTORC1反饋抑制PI3K通路[14]。最新研究表明通過負性調(diào)節(jié)mTORC1，可以抑制IRS-1、阻斷PI3K信號通路導致IR，且低氧條件下mTOR表達會增強[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)與NC組相比，間歇低氧環(huán)境下的IH4組、IH8組mTOR蛋白在大鼠肝細胞胞質(zhì)中的表達逐漸增加，以IH8組增加明顯。同時發(fā)現(xiàn)mTOR蛋白平均灰度值與HOMA-IS呈正相關、與HOMA-IR呈負相關，同樣也說明間歇低氧使增強mTOR的表達并導致IR發(fā)生，且間歇低氧時間延長后IR程度加重。

綜上所述，間歇低氧通過各種可能的機制產(chǎn)生IR已得到共識，而PI3K/Akt途徑作為胰島素主要信號轉(zhuǎn)導通路在間歇低氧導致的IR中也發(fā)揮重要作用，此途徑中的兩個負向調(diào)節(jié)因子GSK-3、mTOR升高均可引發(fā)IR，兩者在OSAHS合并2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制其活性有望成為治療OSAHS合并2型糖尿病的新靶點。

本文圖1見封3。

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Effects of intermittent hypoxia on the expression of GSK-3 and mTOR in rat liver

Ren Guomei，Ren Shouan.Department of Respiration，The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Ren Shouan，Email：renshouan@163.com

ObjectiveTo determine the expression of glycogen synthase kinase-3（GSK-3）and mammalian target of rapamycin（mTOR）in the liver of rats exposed to intermittent hypoxic，and to observe the effects of intermittent hypoxia on the insulin signaling pathway.MethodsTwenty four healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups according to the random number table:intermittent air group（NC group），4 weeks of intermittent hypoxia group（IH4 group）and 8 weeks of intermittent hypoxia group（IH8 group），with 8 rats in each group.Each day from 9:00 am to 5:00 pm，rats in NC group were housed in intermittent air cabin，while rats in IH4 group and IH8 group were housed in intermittent lowoxygen cabin.Fasting blood glucose and fasting insulin（FINS）were tested.Homeostasis model assessment ofinsulin sensitive index（HOMA-IS）and homeostasis model assessment of insulin resistance index（HOMA-IR）were used to evaluate insulin resistance.The expression of hepatic GSK-3 and mTOR were determined by immunohistochemical method and the amount of protein expression was evaluated by average gray value.ResultsCompared with NC group，HOMA-IS was reduced and fasting blood glucose，F(xiàn)INS，HOMA-IR were elevated in IH4 group and IH8 group，butwasmoreapparentin IH8 group（Fvalueswere 62.52，100.375，68.90，85.49，allP＜0.01）.Compared with NC group，the expression of GSK-3 and mTOR protein were increased in IH4 group and IH8 group，especiallyin IH8 group（Fvalues were 72.25，148.01，allP＜0.01）.Pearson correlation analysis showed that the average gray values of GSK-3 and mTOR were positively correlated to HOMA-IS （r=0.786，0.811，allP＜0.01），and negatively correlated with HOMA-IR（r=-0.882，-0.889，allP＜0.01）.ConclusionsIntermittent hypoxia increases the expression of GSK-3 and mTOR in the liver of rats，thus induces insulin resistance.

Intermittent hypoxia；Insulin resistance；Glycogen synthase kinase-3；Mammalian target ofrapamycin

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：77-80）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.02.002

山西科技研究基金資助項目（2013011048-4）

030001 太原，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸科

任壽安，Email：renshouan@163.com

2014-12-08）