王園園　谷體心　李冬　張麗靜

microRNAs在大腸癌診斷和預(yù)后中作用

王園園谷體心李冬張麗靜

【關(guān)鍵詞】腫瘤，大腸;micro RNAs

【中圖分類號(hào)】R 735.34

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)16－2510－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.038

收稿日期:(2015－03－30)

項(xiàng)目來(lái)源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào): 20110284)，河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào): H2014206313)

作者單位: 050031石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(王園園、谷體心、張麗靜);河北醫(yī)科大學(xué)2001級(jí)研究生(李冬)

microRNA是一類非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度約18 ～25核苷酸，由基因自發(fā)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，且作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的微小分子，負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。microRNA與其靶向的mRNA完全或不完全匹配結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或阻遏其翻譯，從而影響靶蛋白的生物功能［1］。microRNA在包括大腸癌在內(nèi)的多種癌癥中存在異常表達(dá)，因此，microRNA有可能成為新的腫瘤標(biāo)志物。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)得microRNA大約有700多個(gè)。microRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)存在差異，并且不同類型腫瘤間有不同的microRNA表達(dá)譜［2，3］。這些研究提示microRNA在腫瘤的發(fā)生中可能存在重要作用，檢測(cè)特異性的microRNA表達(dá)變化可能成為發(fā)現(xiàn)早期癌癥的重要手段，microRNA還可以用來(lái)預(yù)測(cè)癌癥的預(yù)后，作為治療效果的觀察指標(biāo)，甚至可能成為根治腫瘤的特效藥物。本文就microRNA在大腸癌診斷和預(yù)后中的研究進(jìn)展作一綜述。

1　大腸癌的發(fā)病和檢測(cè)情況

大腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年約有123萬(wàn)人發(fā)病，每年約有60萬(wàn)患者死于大腸癌［4］。在歐美國(guó)家，隨著對(duì)大腸癌普查手段的廣泛應(yīng)用，對(duì)結(jié)腸腺瘤病變及時(shí)給予切除，大腸癌發(fā)病率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。近年來(lái)，隨著人口的老齡化和飲食習(xí)慣及結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)大腸癌發(fā)病率出現(xiàn)了升高趨勢(shì)。大腸癌的預(yù)后與其分期呈明顯相關(guān)性，早期大腸癌通過(guò)手術(shù)治療可以治愈，晚期大腸癌就預(yù)后很差，因此，如何發(fā)現(xiàn)早期大腸癌是提高大腸癌生存率的關(guān)鍵因素之一。大腸癌發(fā)病過(guò)程較為漫長(zhǎng)，大多散發(fā)大腸癌患者經(jīng)過(guò)從腺瘤到癌變的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程甚至可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，這就為發(fā)現(xiàn)早期大腸癌患者提供了可能。但是早期大腸癌大多沒(méi)有特異性臨床表現(xiàn)，很少有早期大腸癌患者到醫(yī)院就診。目前對(duì)發(fā)現(xiàn)大腸癌最有效的手段是結(jié)腸鏡檢查，這種檢查方法需要清潔腸道，屬于一種侵入性檢查，受檢查比較痛苦，而且很多患者對(duì)結(jié)腸鏡檢查心存恐懼，拒絕行結(jié)腸鏡檢查?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室手段有血清CEA檢測(cè)和糞便潛血試驗(yàn)，這兩種方法對(duì)于大腸癌診斷特異性和靈敏度都較低，因此臨床迫切需要新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)協(xié)助大腸癌早期診斷和監(jiān)測(cè)。

2　將microRNA作為大腸癌腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)

尋找腫瘤標(biāo)志物一直都是腫瘤研究的重要領(lǐng)域。腫瘤標(biāo)志物在癌癥的早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等諸多方面都具有重要作用。一個(gè)良好的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該能夠反映腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)，在腫瘤的發(fā)生初期就有特異性升高，腫瘤控制后水平趨于穩(wěn)定，根治性切除腫瘤后，腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該迅速下降，腫瘤復(fù)發(fā)后，腫瘤標(biāo)志物明顯升高。目前，血清CEA水平是針對(duì)大腸癌診斷的常用腫瘤標(biāo)志物。但是，血清CEA水平對(duì)大腸癌診斷的敏感性和特異性都不高。在這方面，microRNA是一種優(yōu)秀的新型腫瘤標(biāo)志物候選者。研究發(fā)現(xiàn)健康志愿者和大腸癌患者血清之間存在microRNA的表達(dá)差異［5］。雖然對(duì)于血清中microRNA的具體來(lái)源還不清楚，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中過(guò)表達(dá)的microRNA在血清中也升高，提示血清中過(guò)表達(dá)的microRNA可能是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞。將microRNA作為癌

癥的特異性診斷標(biāo)志物還具有如下優(yōu)勢(shì):(1)一個(gè)microRNA往往調(diào)節(jié)上百個(gè)mRNA表達(dá)，因此，從數(shù)百個(gè)microRNA中尋找癌癥的特異性標(biāo)志物要比從上萬(wàn)個(gè)mRNA中尋找癌癥的特異性標(biāo)志物相對(duì)容易。(2)由于microRAN片段較小并且存在頸環(huán)結(jié)構(gòu)，因此其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其表達(dá)水平不會(huì)因?yàn)闃?biāo)本固定和長(zhǎng)時(shí)間保存等因素而影響檢測(cè)結(jié)果。(3)可以用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)或免疫熒光雜交技術(shù)來(lái)確定microRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。(4)microRNA廣泛存在于體液中，尤其是在血液和糞便中的microRNA有可能成為很有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物［6，7］。

3　血清microRNA在大腸癌診斷中的作用

Chen等應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者和健康志愿者血清中存在明顯不同的microRNA表達(dá)譜。其中發(fā)現(xiàn)有69個(gè)microRNA只有大腸癌患者表達(dá)，正常健康志愿者不表達(dá)這69個(gè)microRNA。當(dāng)然，在這些microRNA中只有一小部分可能成為大腸癌診斷的特異性標(biāo)志物，因?yàn)?，這69個(gè)microRNA中有相當(dāng)一部分在其它癌癥患者中也存在高表達(dá)［5］。Ng等［8］發(fā)現(xiàn)miR-92a在大腸癌患者血清中存在高表達(dá)。他們應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)90例大腸癌患者和50例健康志愿者血清miR-92a表達(dá)水平進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)miR-92a可以作為大腸癌輔助診斷的一個(gè)指標(biāo)，其診斷的敏感性為89%，特異性為70%。

Huang等［9］對(duì)100例大腸癌和59例健康對(duì)照組miR-92a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，也得出了類似結(jié)果。同時(shí)Huang等［9］還發(fā)現(xiàn)miR-29a在大腸癌患者和健康志愿者之間存在明顯的表達(dá)差異，miR-29a作為大腸癌的輔助診斷指標(biāo)，其診斷特異性約為89.1%，敏感性為69%。上述研究還發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-92a表達(dá)水平與大腸癌的腫瘤分期無(wú)關(guān)。

最近，Toiyama等［10］對(duì)186例大腸癌患者，43例大腸腺瘤患者和53例健康志愿者的血清microRNA21表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清microRNA21與大腸癌組織中的micoRNA表達(dá)成平行關(guān)系，大腸癌行根治手術(shù)后血清microRNA21表達(dá)水平明顯下降。在大腸癌、大腸腺瘤和健康志愿者之間，血清microRNA21表達(dá)水平存在顯著差異，研究認(rèn)為血清microRNA21可以作為大腸癌早期診斷腫瘤標(biāo)志物［10］。

4　糞便microRNA在大腸癌診斷中的作用

正常大腸黏膜細(xì)胞和發(fā)生腫瘤的大腸黏膜細(xì)胞每天都進(jìn)行更新，脫落的大腸細(xì)胞隨大便排出，這些脫落細(xì)胞中攜帶有豐富的遺傳信息，而多數(shù)大腸癌發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，因此，從理論說(shuō)，通過(guò)對(duì)脫落細(xì)胞進(jìn)行DNA、RNA、蛋白和microRNA的檢測(cè)可以協(xié)助發(fā)現(xiàn)早期大腸癌。

microRNA性質(zhì)穩(wěn)定，不像蛋白和信使RNA那樣容易發(fā)生降解，因此，通過(guò)檢測(cè)microRNA在糞便中的表達(dá)水平可以協(xié)助發(fā)現(xiàn)早期大腸癌。但是，糞便中大部分microRNA是食物來(lái)源的，人源性microRNA在糞便中只占有很小的比例，約占2%，如何去除食物來(lái)源的microRNA對(duì)診斷的干擾是需要解決的首要問(wèn)題。通過(guò)改進(jìn)大便標(biāo)本的準(zhǔn)備方法，RNA制備方法，現(xiàn)在已經(jīng)有商業(yè)化試劑盒可以獲得高純度的大便RNA標(biāo)本來(lái)用于microRNA檢測(cè)。Ahemd等［11］對(duì)糞便microRNA作為大腸癌腫瘤標(biāo)志物的可能性進(jìn)行了研究，他們首先應(yīng)用芯片技術(shù)對(duì)處于不同分期的大腸癌患者和健康志愿者糞便microRNA水平進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)有202個(gè)microRNA表達(dá)水平有明顯差異，其中141個(gè)microRNA在大腸癌患者中表達(dá)升高，61個(gè)microRNA表達(dá)水平下降。對(duì)其中變化較大的20個(gè)microRNA進(jìn)行了定量研究，確定12個(gè)microRNA(miR-7，miR-17，miR-20a，miR-21，miR-92a，miR-96，miR-106a，miR-134，miR-183miR-196a，miR-199a-3p，miR-214)在大腸癌糞便中明顯升高，其升高水平反映了大腸癌腫瘤中microRNA變化，認(rèn)為可以將糞便microRNA檢測(cè)作為大腸癌診斷的腫瘤標(biāo)志物［11］。

5　microRNA在大腸癌治療和預(yù)后中的作用

盡管隨著外科手術(shù)技巧的提高，可以對(duì)很多以前不能手術(shù)的大腸癌患者進(jìn)行根治性手術(shù)，但是仍有相當(dāng)一部分患者會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床上也有相當(dāng)一部分大腸癌患者對(duì)化療不敏感。臨床醫(yī)師需要應(yīng)用可靠的腫瘤標(biāo)志物來(lái)判斷患者對(duì)治療的反應(yīng)，估計(jì)患者的預(yù)后。microRNA可以判斷大腸癌患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療。

Pu等［12，13］用定量RTPCR方法對(duì)103例大腸癌和37例健康志愿者血漿microRNA21，microRNA221，microRNA222進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)血漿microRNA221與大腸癌預(yù)后明顯相關(guān)，microRNA221升高患者預(yù)后不良。Tsai等［14］發(fā)現(xiàn)血清microRNA148a降低大腸癌患者容易發(fā)生早期復(fù)發(fā)，microRNA148a降低是大腸癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。

Qian等［15］研究發(fā)現(xiàn)microRNA-143在大腸癌腫瘤組織和血清中表達(dá)降低，在體外實(shí)驗(yàn)中增高microRNA-14的表達(dá)水平，可以抑制大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并且增強(qiáng)奧沙利鉑多大腸癌細(xì)胞的殺傷作用。

目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)的種子細(xì)胞，Yu等［16］發(fā)現(xiàn)大腸癌腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)microRNA21，在

細(xì)胞系中下調(diào)microRNA21的表達(dá)可以誘導(dǎo)類似的腫瘤干細(xì)胞分化，耐受化療藥物的大腸癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物再次敏感。

6　microRNA常用檢測(cè)手段及存在的問(wèn)題

到目前為止，檢測(cè)microRNA的常用方法有: northern印跡，cDNA芯片技術(shù)，Solexa測(cè)序，應(yīng)用磁珠的流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR技術(shù)。microRNA片段很短，最多只有25個(gè)核苷酸，并且有些microRNA之間只存在單個(gè)核苷的差異，因此用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸很難獲得特異性擴(kuò)增?？上驳氖峭ㄟ^(guò)錨定核酸技術(shù)可以解決這個(gè)問(wèn)題，錨定核酸探針可以獲得很好的特異性。cDNA芯片技術(shù)常用于高通量的microRNA檢測(cè)，它可以同時(shí)對(duì)數(shù)百個(gè)microRNA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，多用于microRNA的篩查，用該方法檢測(cè)便捷、高效，但是檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果，仍需要用northern印跡或RT-PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，防止假陽(yáng)性。RT-PCR技術(shù)是目前監(jiān)測(cè)microRNA的常用手段，這種監(jiān)測(cè)方法敏感、沒(méi)有放射污染，同時(shí)可以做到相對(duì)定量監(jiān)測(cè)，但是，這種方法也存在一些不足，因?yàn)閼?yīng)用不同的內(nèi)參照物，可能會(huì)得出不同的監(jiān)測(cè)結(jié)果，現(xiàn)在通常建議用多個(gè)內(nèi)參照物來(lái)監(jiān)測(cè)來(lái)彌補(bǔ)其缺陷。目前常用的內(nèi)參照物有l(wèi)et-7A，miR-16，miR-26a，miR-345，miR -425和miR -454［17］。

microRNA的異常表達(dá)在大腸癌發(fā)病和進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用，多種在腫瘤組織中異常表達(dá)的microRNA在血液中也存在異常表達(dá)，而且這種表達(dá)異常存在平行。隨著，microRNA檢測(cè)技術(shù)水平的提高，通過(guò)對(duì)大樣本人群的前瞻性研究，有望在不久的將來(lái)發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸癌有指導(dǎo)意義的microRNA腫瘤標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)

1 Garzon R，F(xiàn)abbrim，Cimmino A，et al.MicroRNA expression and function in cancer.Trendsmol，2006，12:580-587.

2 Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat.Rev.Cancer，2006，6:259-269.

3 AslammI，Taylor K，Pringle JH，et al.MicroRNAs are novel biomarkers of colorectal cancer.Br J Surg，2009，96:702-710.

4 Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008.Int J Cancer，2010，127:2893-2917.

5 Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization ofmicroRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res，2008，18:997-1006.

6 mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.CirculatingmicroRNAs as stable blood-basedmarkers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105:10513-10518.

7 Turchinovich A，Weiz L，Langheinz A，et al.Characterization of extracellular circulatingmicroRNA.Nucleic Acids Res，2011，39:7223-7233.

8 Ng EK，Chong WW，Jin H，et al.Differential expression ofmicroRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potentialmarker for colorectal cancer screening.Gut，2009，58:1375-1381.

9 Huang Z，Huang D，Ni S，et al.PlasmamicroRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer.Int J Cancer，2010，127:118-126.

10 Toiyama Y，Takahashim，Hur K，et al.SerummiR-21 as a Diagnostic and Prognostic Biomarker in Colorectal Cancer.J Natl Cancer Inst，2013，105:849-859.

11 Ahmed FE，Ahemd NC，Vos PW，et al.DiagnosticmicroRNAmarkers to screen fo sporadic human colon cancer in stool: I.proof of principle.Cancer Genomics Proteomics，2013，10:93-113.

12 Pu XX，Huang GL，Guo HQ，Guo CC，Li H，Ye S，Ling S，Jiang L，Tian Y，Lin TY.J Gastroenterol Hepatol，2010，25:1674-1680.

13 Tamas L.CirculatingmiR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognosticmarker of colorectal cancer and is correlated with p53 expression.Cancer，2009，67:456-461.

14 Tsai HL，Yang IP，Huang CW，et al.Clinical significance ofmicro-RNA-148a in patients with early relapse of stage II stage and III colorectal cancer after curative resection.Transl Res，2013，27:219-223.

15 Qian X，Yu J，Yin Y，et al.MicroRNA-143 inhibits tumor growth and angiogenesis and sensitizes chemosensitivity to oxaliplatin in colorectal cancers.Cell Cycle，2013，12:1385-1394.

16 Yu Y，Sarkar FH，Majumdar AP.Down-regulation ofmiR-21 Induces Differentiation of Chemoresistant Colon Cancer Cells and Enhances Susceptibility to Therapeutic Regimens.Transl Oncol，2013，6:180-186.

17 Chang KH，Mestdagh P，Vandesompele J，et al.MicroRNA expression profiling to identify and validate reference genes for relative quantification in colorectal cancer.BMC Cancer，2010，10:173.