林 麗，吳 超，劉 勇，陳軍浩

(1. 解放軍第532醫(yī)院，安徽 黃山 245000；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210008；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

云芝糖肽對健康人外周血淋巴細胞的體外免疫調(diào)節(jié)作用

林 麗1,2，吳 超3，劉 勇3，陳軍浩3

(1. 解放軍第532醫(yī)院，安徽 黃山 245000；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210008；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

目的 探討云芝糖肽在體外對細胞免疫和體液免疫功能調(diào)節(jié)的可能機制。方法 分離健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),分為PBMCs空白組、云芝糖肽20 μL與PBMCs共培養(yǎng)組和云芝糖肽40 μL與PBMCs共培養(yǎng)組，3組分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h采用流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群的比例變化及T淋巴細胞表面CD3+/ HLA-DR+、B淋巴細胞表面CD19+/CD69+表達情況，ELISA方法檢測上清液中IgG水平。結(jié)果 云芝糖肽與PBMCs共培養(yǎng)組CD4+T細胞比例明顯上升(P<0.05)，CD4+/CD8+細胞比值明顯增高(P<0.05)；云芝糖肽20 μL與PBMCs共培養(yǎng)組T細胞表面CD3+/HLA-DR+，72 h時表達水平高于24 h(P<0.05)；B細胞表面CD19+/CD69+的表達顯示從培養(yǎng)24 h到48 h表達升高而在72 h表達減少的趨勢；PBMCs與云芝糖肽共培養(yǎng)2組上清IgG水平均明顯高于PBMCs空白組(P均<0.05)。結(jié)論 云芝糖肽在體外能促進CD4+T細胞比例上升及CD8+T細胞比例下降，提高CD4+/CD8+比值，并增加IgG分泌，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

云芝糖肽；淋巴細胞亞群；外周血單個核細胞；CD3+/HLA-DR+；CD19+/CD69+；IgG

云芝糖肽( polysaccharopeptide, PSP)是一種混合蛋白多糖,是從云芝COV-1菌株菌絲體中提取出來的主要活性成分[1]，在臨床上廣泛用于惡性腫瘤和慢性乙型肝炎等疾病的聯(lián)合治療。許多體內(nèi)外試驗已證明PSP具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[2-3]，但對于其免疫調(diào)節(jié)機制及對細胞免疫和體液免疫影響的具體環(huán)節(jié)和途徑研究報道不多。為了進一步探討PSP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的途徑，本實驗在體外將PSP與健康人外周單個核細胞(PBMCs)共培養(yǎng)，觀測PSP對健康人T細胞及其亞群以及B細胞的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗材料

1.1.1標(biāo)本來源 7例健康者系南京市鼓樓醫(yī)院科研部研究生，其中男1例，女6例；平均年齡29歲。

1.1.2試劑與器材 PSP(南京老山藥業(yè)股份有限公司，批號：080701，為棕色粉末，密封，陰涼干燥處保存，用RPMI1640培養(yǎng)液溶解經(jīng)冷凍干燥的PSP，配制成10 g/L的PSP藥液，0.22 μm 濾膜過濾，4 ℃冰箱保存)；淋巴細胞分層液(Norway公司)；胎牛血清(Invitrogen公司，濾膜過濾，-20 ℃儲存?zhèn)溆?； RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；混合抗體A:MultitestTMCD3/CD16+CD56/CD45/CD19、混合抗體B:MultitestTMCD3/CD8/CD45/CD4(BD BScience公司)；PercP-cy5.5 conjugated Anti-human CD3、FITC Conjugated Anti-human CD4(eBioscience公司)；FITC Mouse Anti-human CD8、FITC Mouse Anti-human HLA DR、PE Mouse Anti-human CD69、FITC Mouse Anti-human CD19(BD Biosciences公司)；人白介素IgG酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測試劑盒(ALPHA DLAGNOSTIC INTERNATIONAL公司)；深低溫冰箱(Thermal公司)；流式細胞儀(BECTON DICKINSON公司)；微型離心機(Sigma公司)；5 mL、50 mL離心管(美國Corning 公司)； Sunrise多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)。

1.2實驗方法 無菌條件下取健康人外周靜脈血25 mL，以肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離PBMCs，將分離到的細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞濃度為1×106L-1，加入到24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔。實驗分為3組：A組為PBMCs空白組，B組為PBMCs+PSP 20 μL(200 mg/L)共培養(yǎng)組，C組為PBMCs+PSP 40 μL(400 mg/L)共培養(yǎng)組。將所有細胞置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h收集細胞和上清，備用。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1淋巴細胞亞群的測定

1.3.1.1培養(yǎng)前淋巴細胞亞群的測定 每個健康人的外周血在分離PBMCs之前各留取抗凝血1 mL。取2個流式管，分別加入混合抗體A和混合抗體B 5 μL，再各加入外周全血50 μL，振蕩，室溫避光孵育20 min；加入紅細胞裂解液1 000 μL，混勻，室溫避光10 min；洗滌離心(1 500 r/min)5 min，棄去上清液，加入生理鹽水1 mL，振蕩，重復(fù)洗滌l次；重懸加入300 μL生理鹽水，振蕩混勻，制成單細胞懸液；用流式細胞儀檢測，每個樣品檢測106細胞，用FCM軟件分析，計算淋巴細胞中各標(biāo)記細胞的百分率。

1.3.1.2培養(yǎng)72 h后淋巴細胞亞群的測定 當(dāng)PBMCs與PSP共培養(yǎng)72 h后，分別收集3組的細胞懸液。用流式細胞儀檢測，計算淋巴細胞亞群的比例，方法同前。

1.3.2T細胞表面CD3+/HLA-DR+和B細胞表面CD19+/CD69+抗原表達的檢測 分別在PBMCs與PSP共同培養(yǎng)的24 h、48 h、72 h收集各組的細胞懸液。各取2個流式管，一管中添加CD3抗體和HLA-DR抗體各5 μL；另一管中添加CD19抗體和CD69抗體各5 μL；充分振蕩、混勻細胞懸液，向每支流式管中添加細胞懸液各200 μL，振蕩；避光孵育20 min；向每支流式管中加入生理鹽水1 mL，振蕩，離心(1 500 r/min)5 min；棄上清，重懸加入生理鹽水200 μL，振蕩混勻，用流式細胞儀檢測，計算CD3+/HLA-DR+和CD19+/CD69+的表達率。

1.3.3培養(yǎng)上清中IgG表達水平的檢測 用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IgG的表達水平，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1各組外周血淋巴細胞亞群比較 A組培養(yǎng)前和培養(yǎng)72 h T細胞百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；培養(yǎng)72 h后，C組CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值均明顯高于培養(yǎng)72 h A組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組外周血T淋巴細胞亞群比較

注：①與培養(yǎng)72 h PBMCs空白組比較，P<0.05。

2.2各組T細胞表面CD3+/HLA-DR+和B細胞表面CD19+/CD69+表達情況 相同時間點時，3組間CD3+/HLA-DR+的表達C組>B組>A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；B組培養(yǎng)72 hT細胞表面CD3+/HLA-DR+的表達高于24 h(P<0.05)。B細胞表面CD19+/CD69+的表達沒有顯著的時間依賴性和濃度依賴性，但在均數(shù)上體現(xiàn)了從24 h到48 h表達的升高然后到72 h的減少的趨勢。見表2。

2.3各組IgG水平比較 相同時間點上，除B組培養(yǎng)48 h與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，B組與C組IgG的表達水平均高于空白組(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

PSP是云芝的主要活性成分，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。研究已經(jīng)表明PSP能夠提高白細胞和中性粒細胞計數(shù)和血清IgG和IgM的水平，并且可減緩非小細胞肺癌患者的惡化程度[4]。PSP也能中和環(huán)磷酰胺對于白細胞數(shù)目、IL-2產(chǎn)生的抑制反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。在食管癌、胃癌和肺癌患者化療和放療的過程中，給予服用PSP能夠減輕癥狀和預(yù)防免疫狀態(tài)的下降[5]。另外PSP能顯著增加CD4+T細胞的數(shù)量、CD4+/CD8+的比值以及B淋巴細胞的數(shù)量和百分率，使腫瘤患者的免疫系統(tǒng)得以增強[6-7]。在動物實驗中，Ho等[8]發(fā)現(xiàn)PSP可以促進鼠脾淋巴細胞的增殖，增加鼠脾淋巴細胞釋放IL-2，IL-12、IFN-γ和IL-18等Th1型細胞因子；在體外細胞培養(yǎng)模型中，發(fā)現(xiàn)PSP(50～200 mg/L)可促進PHA誘導(dǎo)的人外周血淋巴細胞IL-6的高效表達[9]。因此PSP可以增強T、B淋巴細胞作用，促進Th1型細胞因子生成，促進抗體的產(chǎn)生。

表2 各組T細胞表面CD3+/HLA-DR+和B細胞表面CD19+/CD69+表達情況

注：①與同組培養(yǎng)24 h比較，P<0.05。

表3 各組IgG水平比較

注：①與A組比較，P<0.05。

T細胞亞群可分為CD4輔助亞群和CD8抑制亞群，在正常情況下，CD4+/CD8+比值相對恒定，以維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡[10]。CD4+輔助性T細胞通過其TCR分子對抗原肽和MHCⅡ類分子復(fù)合物的識別，輔助Tc細胞發(fā)揮殺傷功能和B細胞產(chǎn)生抗體。CD8+T細胞中的CTL和Ts細胞，通過TCR識別特異性抗原和MHCⅠ類分子復(fù)合物，發(fā)揮其對病毒、寄生蟲、細菌以及腫瘤細胞的殺傷作用，Ts細胞同時在免疫功能的調(diào)節(jié)和抑制中發(fā)揮一定的作用，Ts比值升高時免疫功能受到抑制[11]。CD8陽性細胞對CD4陽性細胞具有調(diào)節(jié)性抑制作用，CD4+/CD8+比值可反應(yīng)機體的免疫功能狀態(tài)[12]。

HLA-DR是MHCⅡ類分子，表達于B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化T淋巴細胞表面，靜止期T細胞不表達此類分子。在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和免疫細胞間的相互作用過程中，HLA-DR被認(rèn)為是促進免疫應(yīng)答的一類重要輔佐分子，在抗原提呈和胸腺選擇中起作用，CD3+T淋巴細胞表達的HLA-DR被認(rèn)為是晚期激活抗原，CD3+/HLA-DR+表示T細胞的激活狀態(tài)[13]。CD69是由2個相同的單體經(jīng)不同糖基化后構(gòu)成的細胞表面雙體蛋白，CD69在淋巴細胞被絲裂原或抗原刺激活化后快速產(chǎn)生，是最早表達的一個活化標(biāo)志。大部分活化的T細胞、少量的靜止期T、B細胞表達此分子。由于CD69在正常個體只有少量T細胞低水平表達，CD69在外周血淋巴細胞表面的表達可作為一個近期淋巴細胞活化的標(biāo)志[14]。

本實驗在體外將PSP與健康人PBMCs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示：健康人的PBMCs在PSP作用下培養(yǎng)72 h，其T淋巴細胞亞群比例出現(xiàn)顯著變化，表現(xiàn)為CD4+T細胞明顯增加，CD4+/CD8+比值增加。根據(jù)產(chǎn)生的細胞因子的類型和生物學(xué)功能，人類CD4+T細胞至少可以分為Th1、Th2 和Th0 3類亞型。Ho等[8]認(rèn)為PSP可作為一種淋巴細胞致有絲分裂因子而促進Th1相關(guān)的細胞因子的產(chǎn)生。同時在PSP的刺激下，T細胞表面CD3+/HLA-DR+和B細胞表面CD19+/CD69+的比率均增高。CD4陽性細胞的增加、CD4+/CD8+比值增加表明宿主的免疫增強，通過MHC Ⅱ類抗原HLA-DR誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致CD4+T細胞的活化和產(chǎn)生各種細胞因子，同時誘導(dǎo)CD8+或者CD4+T細胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)增強[16]。淋巴細胞亞群的改變和T、B細胞表面分子表達的變化趨勢均提示輔助性T細胞增多，抑制性T細胞減少，改善了機體內(nèi)的細胞免疫狀態(tài)，提示T、B細胞活化，使機體細胞免疫功能活性增強，提高了人體的免疫力。

B淋巴細胞是體內(nèi)唯一能產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)的細胞，其受到抗原刺激后可分化為產(chǎn)生抗體的漿細胞，進而產(chǎn)生不同活性的抗體，與相應(yīng)的抗原結(jié)合，從而在體內(nèi)介導(dǎo)多種生理效應(yīng)，引起各種抗原-抗體反應(yīng)，激活補體及參與免疫調(diào)節(jié)等。B淋巴細胞受抗原或有絲分裂原刺激后，可引起分裂增殖，分化為漿母細胞，進而成熟為具有抗體生成能力的漿細胞，合成抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，發(fā)揮IgG抗體的保護性功能[16]。本實驗中B細胞表面CD19+/CD69+表達提高，IgG水平增加，均可表明PSP能夠激活體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)。

綜上所述，PSP作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能顯著增加CD4+T細胞的數(shù)量，提高CD4+/CD8+比值，促進B細胞IgG的分泌，促進T、B淋巴細胞的活化，從而增強細胞免疫和體液免疫功能，這可能是PSP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制之一。

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Immune regulation effect of Polysaccharopeptide on human peripheral blood lymphocytes in vitro

LIN Li1,2, WU Chao3, LIU Yong3, CHEN Junhao3

(1.The 532nd Hospital of PLA, Huangshan 245000, Anhui, China; 2.Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu, China; 3.Affiliated Drumtower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu, China.)

Objective It is to approach the mechanism of polysaccharopeptide (PSP) on immune regulation in cellular and humoral in healthy humans peripheral blood lymphocytes in vitro. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were obtained by leukapheresis followed by ficoll-density centrifugation. The isolated cells were plated on 24-well plates (1 000 μL per well) at a concentration of 1×106cells per milliliter in RPMI1640 supplemented with 10% fetal calf serum. The PBMCs were divided into three groups and were cultured for 72 hours in vitro. Flow cytometry was used to assess the percentages of human lymphocyte subsets. The expression of CD3+/HLA-DR+T cells and CD19+/CD69+B cells were measured by Flow cytometry at 24, 48 and 72 hours. The level of IgG in the supernatant was measured by enzymelinked immuno-sorbent assay (ELISA) at 24, 48 and 72 hours. Results After 72 hours of culture, the percentage of CD4+T cells in PBMCs+PSP groups were increased significantly as compared with those in PBMCs group (allP<0.05). Moreover, the ratio of CD4+/CD8+in PBMCs+PSP groups were significantly increased compared with those in PBMCs group (P<0.05). The expression of CD3+/HLA-DR+of T lymphocytes in PBMCs+PSP 20 μL group at 72 hours was significantly higher at 24 hours (allP<0.05). PSP could obviously increase the level of IgG at 24, 48 and 72 hours. Conclusion The PSP can promote the rise of CD4+and the decline of CD8+, and increase CD4+/CD8+ratio and the secretion of IgG, so it have a certain role in immune regulation.

polysaccharopeptide; Lymphocyte subsets; CD3+/HLA-DR+; CD19+/CD69+; IgG

林麗，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合感染病學(xué)。

吳超，E-mail：wuchao@jlonline.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.03.007

R965

A

1008-8849(2015)03-0248-04

2014-06-20