丁 璇，洪戰(zhàn)英，柴逸峰（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433）

?綜述?

中藥活性成分的高通量篩選新技術(shù)

丁 璇，洪戰(zhàn)英，柴逸峰（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433）

以近年來國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，總結(jié)概括了近5年來中藥活性成分的高通量篩選新技術(shù)的進(jìn)展情況。其中生物色譜技術(shù)、芯片技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選等技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。這些新技術(shù)在中藥活性成分篩選方面，比起傳統(tǒng)方法具有效率高、自動(dòng)化、通量高的優(yōu)點(diǎn)，可以為中藥活性成分的高通量篩選提供新思路。

生物色譜；芯片；虛擬篩選；中藥；活性成分；高通量

中藥擁有幾千年的傳承歷史，人們?cè)诩膊☆A(yù)防、診斷和治療中積累了大量的中藥使用經(jīng)驗(yàn)，并形成了系統(tǒng)性的理論［1］。現(xiàn)今在全球范圍約有20%的人在使用天然藥物和中藥，青蒿素的廣泛使用就是一個(gè)成功的范例［2］。在美國(guó)，雖然中藥已被批準(zhǔn)作為一種營(yíng)養(yǎng)添加劑來使用［3］，不必進(jìn)行等同于處方藥的安全有效性評(píng)價(jià)，但是，為了讓中藥得到進(jìn)一步的認(rèn)可，真正走出國(guó)門，篩選出確切的中藥活性成分就顯得尤為重要。

現(xiàn)今，中藥藥效研究和活性成分篩選的主要目標(biāo)成分依然是中藥里含量較高的一些標(biāo)志物［4］。這些標(biāo)志物因?yàn)楹扛?、易提純，可以使用傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行篩選。傳統(tǒng)方法常使用一些經(jīng)典的動(dòng)物、細(xì)胞模型，但其應(yīng)用又往往因較低的重現(xiàn)性和通量而受到限制。此外，一些具有潛在藥效活性的微量成分因含量較低、難于提純，無(wú)法使用這樣的方法進(jìn)行探究和篩選。為了克服這些難題，實(shí)現(xiàn)中藥活性成分的高通量篩選，生物色譜技術(shù)、芯片技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)等都在近幾年受到了很大的關(guān)注。其中，生物色譜技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)色譜分離理論和生物大分子的活性，兼具色譜分析和生物分析的優(yōu)點(diǎn)，可以相對(duì)真實(shí)地模擬生物體內(nèi)環(huán)境，進(jìn)行相關(guān)的中藥活性藥物篩選；芯片技術(shù)則具有自動(dòng)化、高通量的特點(diǎn)，人工操作所造成的誤差較小；計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)可以有效減少篩選工作的任務(wù)量，提高活性藥物篩選的效率，并且對(duì)在藥物篩選前、中、后期的各個(gè)過程中所得到的結(jié)果均可以進(jìn)行評(píng)價(jià)，為中醫(yī)藥研究人員提供參考。筆者針對(duì)近年來中藥活性成分高通量篩選的這幾項(xiàng)新技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 生物色譜技術(shù)

1.1原理 生物色譜技術(shù)（biochromatography）出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代中后期，是一種將各種生物活性物質(zhì)，如活性大分子、細(xì)胞膜、人工合成膜或細(xì)胞等固定在固定相上的新型色譜技術(shù)［5］，該技術(shù)可以用于篩選活性成分，也可用于活性分子藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的測(cè)定。

1.2技術(shù)路線 如圖1所示，生物色譜模型的建立，首先要分離或培養(yǎng)活性大分子或細(xì)胞等生物材料，然后再將得到的這些生物材料與色譜固定相采用共價(jià)鍵合或者疏水相互作用的方式進(jìn)行結(jié)合固定，從而得到具有活性的生物色譜柱，再將其與自動(dòng)進(jìn)樣器、高效液相色譜儀和質(zhì)譜檢測(cè)器連接，可以實(shí)現(xiàn)在線的高通量自動(dòng)篩選。根據(jù)固定相的不同，生物色譜法分為前沿親合色譜法、生物膜色譜法、細(xì)胞生物色譜法等；根據(jù)樣品處理方法的不同，又可以分為離線生物色譜法和在線生物色譜法。

圖1 生物色譜技術(shù)路線圖

1.3應(yīng)用 將靶標(biāo)或蛋白固定于固定相上，利用靶標(biāo)或蛋白與活性成分特異性結(jié)合的特點(diǎn)來分離或篩選化合物的色譜技術(shù)被稱之為前沿親合色譜。由于蛋白和靶標(biāo)的確定性，以及蛋白固定技術(shù)的穩(wěn)步發(fā)展，才使前沿親合色譜成為一種比較成熟的、重現(xiàn)性較好的生物色譜技術(shù)。Luo等［6］使用兔體內(nèi)血清純化后的多克隆抗體來模擬C型肝炎病毒的蛋白酶，并將其固定于色譜柱固定相上與質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)葉下珠屬草本類植物的提取物中酚酸類物質(zhì)的保留特性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)了云實(shí)素等活性成分，從而建立起一種從天然產(chǎn)物中高通量地篩選高效低毒的治療C型肝炎病毒的活性成分的新方法。Zhao等［7］使用前沿親合色譜的方法，利用G蛋白偶聯(lián)的蛋白色譜柱，對(duì)黃連總提物進(jìn)行了篩選，得到了鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀和藥根堿等活性成分。

生物膜色譜是一種簡(jiǎn)單、可重復(fù)、高效的色譜模型，可以直接反映某些化學(xué)成分的藥效參數(shù)，如活性和結(jié)合力等，可以極大地縮小天然產(chǎn)物中活性成分的篩選范圍［8］。Wang等［9］構(gòu)建了α1A腎上腺受體高表達(dá)的細(xì)胞膜色譜模型，從中藥紅毛七中篩選出了兩種作用于α1A腎上腺受體的活性成分木蘭花堿和紅毛新堿。Zhang等［10］使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4高表達(dá)的HEK293細(xì)胞，構(gòu)建了用于篩選抗癌活性成分的細(xì)胞膜色譜模型，并從甘藍(lán)的多種成分中篩選出了一種芥子酸膽堿成分。Yue等［11］使用一種腎上腺素能受體高表達(dá)的細(xì)胞系，構(gòu)建了用于篩選腎上腺素能受體抑制劑的細(xì)胞膜色譜模型，應(yīng)用該模型從中藥羌活提取物中成功篩選出活性成分歐前胡乙素。為進(jìn)一步提高生物膜色譜的分離分析效率，Chen等［12］利用全二維色譜的方法，建立了一個(gè)新型的全二維細(xì)胞膜色譜模型。該模型同時(shí)使用一根Hep／G2細(xì)胞膜色譜柱和一根整體柱，利用十通閥的切換在兩根柱子上實(shí)現(xiàn)了中藥活性成分的有效分離，并考察了相關(guān)成分的保留情況，發(fā)現(xiàn)了小檗堿和四氫巴馬汀等幾種活性物質(zhì)。多維液相色譜技術(shù)具有較高的峰容量，可以更有效地分離復(fù)雜成分并具有更高分辨率，將其應(yīng)用于生物膜色譜技術(shù)之中，可以有效提高復(fù)雜體系分離分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和信息含量。

全細(xì)胞色譜是一種新興的生物色譜技術(shù)。Yakufu等［13］使用毛細(xì)管電泳與全細(xì)胞結(jié)合的方法，將CCR4高表達(dá)的細(xì)胞固定在毛細(xì)管壁上，構(gòu)建了一個(gè)全新的細(xì)胞毛細(xì)管電泳模型，可以用于篩選相關(guān)的活性藥物。由于細(xì)胞的完整性，該色譜技術(shù)能更加真實(shí)地模擬體內(nèi)大分子靶標(biāo)的生物活性，對(duì)于藥物篩選更加靈敏可信，但是在細(xì)胞固定方面還存在較大難度。

2 芯片技術(shù)

2.1原理 生物芯片（bio-chip）將生物活性材料（寡聚核苷酸、DNA、多肽、抗原、抗體乃至細(xì)胞和模式動(dòng)物等）以陣列形式固定于支持物的表面，可以在其上同時(shí)進(jìn)行數(shù)千乃至上萬(wàn)次實(shí)驗(yàn)，從而達(dá)到高通量、快速篩選的目的［14］。通常來說，生物芯片與拇指一般大，固定于其上的生物活性物質(zhì)微小，以點(diǎn)陣的方式排列在硅基上，很像計(jì)算機(jī)的芯片，所以它被稱為“生物芯片”。采用微電子學(xué)的并行處理和高密度集成技術(shù)，可利用軟件同時(shí)并行分析成千上萬(wàn)種生物樣品，具有高通量、微型化、自動(dòng)化以及檢測(cè)樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。

2.2技術(shù)路線 如圖2所示，生物芯片的篩選步驟主要包括靶標(biāo)驗(yàn)證部分、篩選部分及后期優(yōu)化部分。即先通過前期實(shí)驗(yàn)確證或者文獻(xiàn)報(bào)道搜尋的方式得到具體作用靶標(biāo)，然后再將相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白、受體、DNA等大分子甚至是特定細(xì)胞或生物個(gè)體接種于芯片之上，使用備選庫(kù)中的藥物與芯片作用反應(yīng)，通過檢測(cè)熒光變化或者其他各種生化指標(biāo)等來判斷藥物結(jié)合力和作用的強(qiáng)弱，最終進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化或者修飾，并進(jìn)行進(jìn)一步確證。2.3應(yīng)用 在過去幾年里，分子水平的活性測(cè)定（受體結(jié)合和酶活抑制等）為天然產(chǎn)物的活性成分篩選打開了一條全新的思路［15］，因而生物芯片在分子水平層面得到了很大程度的發(fā)展。隨著高通量分析技術(shù)的完善，利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)，可以對(duì)中藥有效成分進(jìn)行更加準(zhǔn)確的篩選。

圖2 生物芯片技術(shù)路線圖

在基因研究層面，生物芯片將大量特定序列的核酸片段有序地固定在載體上與標(biāo)記核酸分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來判斷樣品中靶分子的組成及數(shù)量。Ren等［16］利用基因芯片，觀察了丹參總提物、丹參親水性成分與親脂性成分對(duì)HUVEC細(xì)胞系基因表達(dá)水平的影響，并發(fā)現(xiàn)親脂性成分對(duì)其基因表達(dá)水平的影響要大于另外兩組，共有511個(gè)基因發(fā)生顯著變化，其中236種基因表達(dá)水平上調(diào)，并證明丹參親脂性成分對(duì)血管異常增生引起的疾病具有一定的治療作用。Liu等［17］使用基因芯片和基因組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)中藥四物湯方劑具有潛在的植物激素樣活性，并提出了利用天然產(chǎn)物中植物激素治療癌癥的可行性。

在蛋白研究層面，生物芯片的制備是通過把預(yù)先制備好的蛋白靶標(biāo)固定于經(jīng)化學(xué)修飾的玻片或硅片等載體上，使蛋白質(zhì)與載體表面結(jié)合，同時(shí)仍保留蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物活性。Song等［18］利用商業(yè)化的CM 10蛋白芯片，針對(duì)慢性乙肝患者，對(duì)中醫(yī)理論中“證”的情況進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)了4種潛在的生物標(biāo)志物。Li等［19］通過動(dòng)物模型試驗(yàn)確定了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎表達(dá)的幾種差異蛋白，然后使用這些蛋白構(gòu)建了蛋白芯片，發(fā)現(xiàn)TRAIL和Neuropilin-2蛋白在其病程中發(fā)揮著重要作用，TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞因子及其結(jié)構(gòu)類似物可以作為一種腫瘤治療的新型活性成分。

隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，特定細(xì)胞乃至模式生物個(gè)體層面的芯片技術(shù)也逐漸得到了發(fā)展。Carr等［20］利用線蟲為模式生物模型，將其置于微流控芯片上，使用多種藥物液滴與其進(jìn)行相互作用，通過觀測(cè)給藥前、給藥時(shí)和給藥后的各項(xiàng)指標(biāo)，測(cè)定咪唑類藥物的藥效情況，從而達(dá)到高通量篩選的目的。Sandoz等［21］搭建了一個(gè)裝有由神經(jīng)干細(xì)胞分化所得的組織樣品的三維微流控芯片，通過檢測(cè)其電生理活動(dòng)情況，可以檢測(cè)潛在活性藥物的有效性和毒性。

生物芯片具有自動(dòng)化、高通量的優(yōu)點(diǎn)，有效避免了大量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)工作，人工干預(yù)造成的誤差較小，因而其所得結(jié)果也較為穩(wěn)定、可靠，這對(duì)于中藥有效成分的體外篩選具有十分重要的意義。

3 計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)

3.1原理 計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)（virtual screen technology）的理論基礎(chǔ)是Emil Fischer（1894年）提出的“鎖鑰原理”［22］，即活性藥物只與體內(nèi)某特定靶點(diǎn)進(jìn)行相互作用，如同鑰匙和鎖一般，其相互作用準(zhǔn)確、精密，且十分依賴分子構(gòu)型和空間位阻效應(yīng)。在20世紀(jì)60年代，Hansch和Fujita等［23］研究發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的定量構(gòu)效關(guān)系，極大地促進(jìn)了近代計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)的發(fā)展。

3.2技術(shù)路線 如圖3所示，篩選目標(biāo)確定后，需要在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索大量分子結(jié)構(gòu)信息，并使用軟件對(duì)其進(jìn)行處理，模擬其與已知靶標(biāo)的結(jié)合情況，然后給出得分函數(shù)和評(píng)價(jià)結(jié)果，最終篩選出一種乃至幾種潛在的有效成分，進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)外藥效作用實(shí)驗(yàn)。

3.3應(yīng)用 計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)的實(shí)現(xiàn)是通過計(jì)算機(jī)軟件來實(shí)現(xiàn)的，它利用計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力，在已經(jīng)構(gòu)建好的待篩選化合物的三維模型數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋與靶標(biāo)位點(diǎn)具有潛在相互作用的分子化合物，從而達(dá)到初步篩選的目的［24］。如今有許多數(shù)據(jù)庫(kù)提供靶標(biāo)蛋白或小分子的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息，如CamMedNP、INC、ACD、TCMD、CNPD、CHM IS-C等［25-28］。但是僅僅具有數(shù)據(jù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，研究者還需要能夠?qū)⑦@些數(shù)據(jù)變?yōu)榭梢暬?、可操作性的篩選模型的軟件。常見的篩選軟件有Sybyl、Insight II、Dock、Gold、Glide、AutoDock、eHiTS、IPA等［29-31］，其中多數(shù)需要在Linux操作系統(tǒng)下的大型服務(wù)器端運(yùn)行，但也有部分軟件可以在預(yù)裝有W indow s系統(tǒng)的個(gè)人電腦端運(yùn)行。

圖3 計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)路線圖

近年來，Karthick等［32］利用計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)，使用TCMD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出一種具有潛在的神經(jīng)絡(luò)氨酸激酶抑制劑活性的先導(dǎo)化合物新葡萄糖蕓苔素，并可以有效治療奧司他韋抗病毒引起的感冒。Tian等［33］使用藥效基團(tuán)和虛擬篩選聯(lián)用的方法，篩選出了多個(gè)結(jié)構(gòu)全新的Rho激酶1抑制劑。Berger等［34］使用DOCK軟件，以脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）為靶標(biāo)，對(duì)100多萬(wàn)種化合物進(jìn)行了虛擬篩選，初步得到了48種化合物，并最終確定了4種活性化合物，其中á-truxillic酸作為一種中藥活性成分，具有抗炎和抗傷害的藥理作用。Wang等［35］使用IPA軟件，對(duì)中藥復(fù)方PHY906作用于荷瘤小鼠的藥理機(jī)制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)其激活了荷瘤小鼠的促凋亡和抗炎通路，并進(jìn)一步證實(shí)了其與化療藥物聯(lián)用時(shí)的減毒增效作用。計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)作為中藥活性成分篩選的一種新興技術(shù)，具有效率高、成本低、速度快、容量大的特性，在中藥活性成分初步篩選過程中，可以對(duì)復(fù)雜體系中的多種成分實(shí)現(xiàn)一定的聚焦效果，縮小篩選范圍。

4 總結(jié)與展望

中藥作為一個(gè)巨大的人類遺產(chǎn)寶庫(kù)，其藥效已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可和驗(yàn)證。但是如何高效快速地篩選、分離出中藥中的活性成分，實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化，這還需要現(xiàn)代技術(shù)的輔佐。

生物色譜技術(shù)、芯片技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)作為新興的技術(shù)手段，相對(duì)于傳統(tǒng)的活性成分篩選技術(shù)具有快速、高通量的分析特點(diǎn)，成本低、效率高。但同時(shí)也要清楚地認(rèn)識(shí)到這些新技術(shù)的應(yīng)用都有其各自的局限性，如生物色譜技術(shù)存在著非特異性結(jié)合的問題，芯片技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要明確的病理作用靶點(diǎn)、蛋白、細(xì)胞或模式生物個(gè)體，計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)會(huì)產(chǎn)生大量假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果等等，因此這些技術(shù)的篩選結(jié)果需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，這些局限性可以通過多種方式逐步解決。例如可以通過制定標(biāo)準(zhǔn)操作步驟和相應(yīng)的質(zhì)控規(guī)范，降低生物色譜重現(xiàn)性差、非特異性吸附所帶來的影響；另外使用全二維色譜模型可以有效提高生物色譜的篩選和分離能力。而在進(jìn)一步優(yōu)化生物芯片結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)其微型化和集成化的同時(shí)，還要進(jìn)一步將該模型信息化，充分挖掘其內(nèi)涵信息，提高活性篩選效率；同時(shí)發(fā)展與質(zhì)譜聯(lián)用的生物芯片技術(shù)。虛擬篩選則需要利用多種篩選算法和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶標(biāo)和活性成分的相互作用進(jìn)行確證，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率和假陰性率；另外，構(gòu)建一個(gè)完整的中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)也是迫在眉睫的任務(wù)。隨著這些新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，它們將成為中藥活性成分高通量篩選所必不可少的工具。

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區(qū)域阻滯麻醉可能對(duì)前列腺癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后有益。一項(xiàng)薈萃分析納入了10項(xiàng)回顧性研究、13 765例接受前列腺癌切除手術(shù)的患者，結(jié)果顯示與單純?nèi)砺樽硐啾?，椎管?nèi)麻醉(復(fù)合或不復(fù)合全身麻醉)未延長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間，但延長(zhǎng)了總生存時(shí)間[17]。在其他腫瘤手術(shù)中，區(qū)域阻滯麻醉患者也顯示出延長(zhǎng)總體生存時(shí)間的作用[18]。但是在腫瘤遠(yuǎn)期預(yù)后方面還缺乏前瞻性研究結(jié)果。

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New technologies for high throughput screening of effective traditional Chinese medicine components

DING Xuan，HONG Zhanying，CHAIYifeng（School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai 200433，China）

The research progresson new technologies for high throughput screening of effective traditional Chinesemedicine（TCM）componentswas summarized based on the recent documents at home and abroad，among which bio-chromatography，chip-technology and computer-aided virtual screen technology were w idely used.Compared w ith traditional screening technology，those new ones had shown advantages in efficiency，automation and high-throughput，providing new ways to screen effective components of TCM w ith high throughput.

bio-chromatography；chip；virtual screen；traditionalChinesemedicine；effective components；high throughput

R917

］ A

1006-0111（2015）03-0193-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.001

2014-02-21

2014-07-18

［本文編輯］ 顧文華

丁 璇，碩士研究生.Tel：（021）81871261；E-mail：155335961＠qq.com

柴逸峰，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：復(fù)雜體系分析.Tel：（021）81871201；E-mail：yfchai＠smmu.edu.cn