楊 宇，王 慧，曹穎瑛，朱臻宇（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，.藥物分析學(xué)教研室；.新藥研究中心，上海 200433）

隨著免疫功能低下患者的增加、器官移植等醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及免疫抑制劑的使用，真菌感染率居高不下，其中白念珠菌成為真菌感染的主要病原菌［1］。

咪康唑因生物利用度好和不良反應(yīng)少成為防治真菌感染的一線藥物。研究表明，咪康唑可通過影響過氧化物酶和線粒體而發(fā)揮抗真菌活性［2］。同時(shí)，咪康唑可增加活性氧使細(xì)胞死亡［3］。然而，目前咪康唑的作用機(jī)制尚不明確，因此研究其作用機(jī)制顯得尤為重要。

在生命系統(tǒng)中，代謝組能將基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的微小變化放大。因此，代謝組學(xué)能更直接地反應(yīng)生物體的功能變化。

筆者基于氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）代謝組學(xué)技術(shù)，研究咪康唑給藥前后白念珠菌的代謝特征譜，結(jié)合藥物作用機(jī)制，探討代謝物產(chǎn)生差異的原因，為闡明藥物作用機(jī)制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Trace Ultra／DSQⅡGC－MS（美國賽默飛公司）；微型漩渦混合儀（美國賽默飛公司）；－80℃低溫冰箱（美國賽默飛公司）；凍干機(jī)（美國Virtis公司）；MJx型智能霉菌培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）。

1.2 試劑 甲氧基胺鹽酸鹽、N－甲基－N－（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、咪康唑均購自Sigma公司；正庚烷（上海晶純實(shí)業(yè)公司）。

1.3 菌株和培養(yǎng)基 白念珠菌SC5314；YPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，溶解于1 000ml三蒸水，高壓滅菌（121 ℃，15min），4 ℃保存。

2 方法

2.1 真菌培養(yǎng)

2.1.1 咪康唑半數(shù)抑菌濃度（IC50）的確定 挑取白念珠菌單克隆，接種至1ml YPD培養(yǎng)液，于30℃，200r／min培養(yǎng)至指數(shù)生長后期，于紫外分光光度計(jì)600nm［4］下測菌液光密度（D）值，用 YPD培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至D值為0.1，取20ml加入各錐形瓶中培養(yǎng)，至D值為0.2時(shí)，給藥組中加入咪康唑，使其終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64μg／ml，繼續(xù)培養(yǎng)（對照組中加入相同體積的二甲基亞砜，其濃度應(yīng)小于0.05%，以確保不影響白念珠菌的生長），分別在3、4、5、6h測定各組的D值。與對照組的D值相比，選擇繼續(xù)培養(yǎng)4h，其中咪康唑的IC50為16μg／ml。

2.1.2 培養(yǎng)條件 按照IC50的測定方法和給藥濃度，培養(yǎng)給藥組和對照組各6份。

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品淬滅 向樣品中加入等體積的60%甲醇（預(yù)冷至－20 ℃），迅速搖勻，靜置5min（－40℃），6 000r／min離心。

2.2.2 樣品提取 樣品用超純水迅速清洗后，重懸于1ml沸水（含10μl 200mmol／L的α－氨基丁酸內(nèi)標(biāo)）［4］，靜置15min，放入 －80 ℃ 冰箱冰 凍15min，取出，60℃水浴溶解15min，再重復(fù)凍融操作2次，13 200r／min離心，取上清液，放置在－20℃冰箱預(yù)凍。后置于凍干機(jī)中凍干，獲得凍干粉。

2.2.3 衍生化 向凍干粉中加入75μl甲氧基胺鹽酸鹽／吡啶溶液，40℃溫孵90min，再加入75μl MSTFA 溶液 （1%TMCS），40 ℃ 溫孵 50min，13 200r／min離心，取上清液，裝入進(jìn)樣小瓶。

2.2.4 菌體干重的測定 將樣品沉淀在室溫下風(fēng)干至恒重，稱樣品干重，至少稱量3次以確保樣品完全干燥。

2.3 GC－MS條件 毛細(xì)管柱：HP－5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：260℃；升溫程序：起始溫度為70℃，保持3min，4℃／min升至220℃，再8℃／min升至310℃，保持10min，圖譜從第7.6分鐘開始采集；載氣：高純氮?dú)?；流速?.0ml／min。進(jìn)樣量為1μl。

電子轟擊源（EI）；離子源溫度：200℃；接口溫度：280℃；電子能量：70eV；調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧；質(zhì)譜掃描方式：掃描范圍15～800amu，掃描速度5s／dec。

2.4 數(shù)據(jù)處理 將原始數(shù)據(jù)（.RAW）經(jīng)Xculibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成CDF格式，利用XCMS軟件對數(shù)據(jù)峰校正和峰積分，并采用 MATLAB 7.0（The MathWorks，Inc.，USA）過濾離子峰，留下相同保留時(shí)間下峰度最大的離子峰。為校正質(zhì)譜響應(yīng)，每個(gè)樣品的各個(gè)峰面積先除以各自的細(xì)胞干重，再除以內(nèi)標(biāo)衍生化后峰度最大的離子峰。利用SIMCA－P V 11.0（Umetrics，Sweden）軟件將數(shù)據(jù)中心化和帕累托變換，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS－DA）分析，根據(jù)variable influence in the projection（VIP）值來預(yù)測代謝物對模型的貢獻(xiàn)程度。VIP＞1的數(shù)據(jù)對模型有明顯貢獻(xiàn)。接著對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，保留P＜0.01的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)與NIST數(shù)據(jù)庫匹配，并用標(biāo)準(zhǔn)品定位，得到潛在的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)果

3.1 GC－MS色譜圖 給藥組和對照組白念珠菌的胞內(nèi)代謝物，經(jīng)提取，衍生化后進(jìn)樣分析，其GC－MS色譜圖，如圖1所示。

圖1 給藥組和對照組的GC－MS色譜圖

3.2 PCA與PLS－DA結(jié)果 數(shù)據(jù)校正后，對給藥組和對照組進(jìn)行PCA和PLS－DA分析，如圖2A和2B所示，結(jié)果表明兩組明顯分開。其載荷圖和S－plot圖，如圖2C和2D所示。載荷圖用于潛在生物標(biāo)志物的篩選，根據(jù)載荷圖所示，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的離子對分類貢獻(xiàn)越大。得到23個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，給藥組和對照組代謝物含量變化見圖3。

4 討論

根據(jù)給藥組和對照組的差異代謝物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別討論如下：

4.1 葡萄糖 給藥組與對照組相比，葡萄糖含量顯著升高。研究表明咪康唑通過影響線粒體ATP酶和鉀離子泵而發(fā)揮抗真菌活性［5］，其中鉀離子泵是主動(dòng)運(yùn)輸，消耗能量，而葡萄糖可產(chǎn)生能量。因此，葡萄糖含量的升高可能與咪康唑作用鉀離子通道有關(guān)。

圖2 給藥組和對照組的主成分分析圖（A）、偏最小二乘法得分圖（B）、載荷圖（C）和S－plot圖（D）

圖3 給藥組和對照組的差異代謝物柱狀圖

4.2 海藻糖 白念珠菌受到外界刺激時(shí)會(huì)采取保護(hù)性防御機(jī)制，其中氧化應(yīng)激刺激細(xì)胞內(nèi)非還原性二糖海藻糖明顯增加［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，咪康唑可能是一種氧化應(yīng)激，給藥后使細(xì)胞內(nèi)海藻糖大量積累，從而起到抗氧化的作用。

4.3 三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物 三羧酸循環(huán)不僅是需氧生物體重要的代謝途徑，還是糖類、脂質(zhì)和氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。酸刺激下，胞外谷氨酸通過反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（GadT）轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，在谷氨酸脫羧酶的作用下生成γ－氨基丁酸（GABA），該反應(yīng)消耗氫離子，使胞內(nèi)pH值升高。進(jìn)而GABA通過GABA支路在GABA／α－酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下脫氨基形成琥珀酸半醛（SSA），SSA在琥珀酸半醛脫羧酶的作用下生成琥珀酸，進(jìn)而影響三羧酸循環(huán)［7］，同時(shí)GABA支路可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧［8］。這與前期的研究結(jié)果相符［9］。由此可知，三羧酸循環(huán)中琥珀酸和檸檬酸含量的降低可能與咪康唑影響GABA支路有關(guān)。

4.4 2－羥基戊二酸（2－HG） 研究表明，2－HG脫氫酶活性降低導(dǎo)致2－HG大量積累，而2－HG脫氫酶可降低DNA和組蛋白的甲基化，從而抑制正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化［10］。因此，咪康唑給藥組2－HG的大量積累可能與2－HG脫氫酶活性降低有關(guān)，從而促進(jìn)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

4.5 氨基酸類 天冬酰胺、天冬氨酸、酪氨酸在給藥組中含量升高。其中，酪氨酸磷酸化參與細(xì)胞信息傳遞，因此酪氨酸的增加可能與細(xì)胞信息傳遞有關(guān)。天冬氨酸和天冬酰胺可合成多種氨基酸。有研究表明，蘇氨酸生物合成中間體β－天冬氨酸半醛（ASA）的積累對細(xì)胞有一定的損傷作用，同時(shí)可加速Gcn4的降解，Gcn4可調(diào)控多種氨基酸和維生素的生物合成［11］。因此丙氨酸、二甲基甘氨酸、纈氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量的降低與咪康唑促使ASA積累有關(guān)。

4.6 磷酸、磷酸甘油、甘油類 磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分。Pasrija等［12］報(bào)道藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白傾向定位于細(xì)胞膜。因此，咪康唑可能通過影響細(xì)胞膜而導(dǎo)致藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性降低，使細(xì)胞內(nèi)的藥物積累而發(fā)揮治療作用。

本實(shí)驗(yàn)基于GC－MS的代謝組學(xué)方法對咪康唑給藥前后白念珠菌的代謝物進(jìn)行研究，經(jīng)比較分析，得到23個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，它們主要參與了氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、氧化應(yīng)激、糖酵解和磷脂代謝等相關(guān)通路，對咪康唑抗真菌作用機(jī)制的闡明具有重要意義。

［1］Kriengkauykiat J，Ito JI，Dadwal SS.Epidemiology and treatment approaches in management of invasive fungal infections［J］.Clin Epidemiol，2011，3：175－191.

［2］Vandenbosch D，De Canck E，Dhondt I，et al.Genomewide screening for genes involved in biofilm formation and micon－azole susceptibility in Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Yeast Res，2013，13（8）：720－730.

［3］Zhu CX，Yan L，Wang XJ，et al.Transposition of the Zorro2retrotransposon is activated by miconazole in Candida albicans［J］.Biol Pharm Bull，2014，37（1）：37－43.

［4］吳海棠，李 祥，王添琦，等.黃芩素作用白假絲酵母菌的GCMS代謝組學(xué)研究［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（2）：184－189.

［5］Calahorra M，Lozano C，Sanchez NS，et al.Ketoconazole and miconazole alter potassium homeostasis in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1808（1）：433－445.

［6］Sanchez－Fresneda R，Guirao－Abad JP，Arguelles A，et al.Specific stress－induced storage of trehalose，glycerol and D－arabitol in response to oxidative and osmotic stress in Candida albicans［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，430（4）：1334－1339.

［7］Feehily C，O＇Byrne CP，Karatzas KA.Functionalγ－Aminobutyrate Shunt in Listeria monocytogenes：role in acid tolerance and succinate biosynthesis［J］.Appl Environ Microbiol，2013，79（1）：74－80.

［8］Cao J，Barbosa JM，Singh NK，et al.GABA shunt mediates thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae by reducing reactive oxygen production［J］.Yeast，2013，30（4）：129－144.

［9］Kobayashi D，Kondo K，Uehara N，et al.Endogenous reactive oxygen species is an important mediator of miconazole antifungal effect［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（10）：3113－3117.

［10］Shim EH，Livi CB，Rakheja D，et al.L－2－h(huán)ydroxyglutarate：an epigenetic modifier and putative oncometabolite in renal cancer［J］.Cancer Discov，2014，4（11）：1290－1298.

［11］Rawal Y，Qiu H，Hinnebusch AG.Accumulation of a threonine biosynthetic intermediate attenuates general amino acid control by accelerating degradation of Gcn4via Pho85and Cdk8［J］.PLoS Genet，2014，10（7）：e1004534.

［12］Pasrija R，Panwar SL，Prasad R.Multidrug transporters CaCdr1p and CaMdr1p of Candida albicans display different lipid specificities：both ergosterol and sphingolipids are essential for targeting of CaCdr1p to membrane rafts［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：694－704.