李焱平，劉禮富，胡高強(qiáng)，張 靜，姜 鮮△

（1．四川省瀘縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科646100；2．瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

β淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）沉積導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷是阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）發(fā)病機(jī)制之一［1］。白藜蘆醇是多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中的提取物，分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228．25，白色針狀晶體［2］。廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或藥物中，以虎杖中含量最高，具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等生物藥理活性［3－4］。但是白藜蘆醇能否減少 Aβ1～42致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）炎癥因子釋放，提高 Aβ1～42刺激后 HUVEC活性目前還不清楚。據(jù)此，本文通過觀察不同劑量白藜蘆醇對Aβ1～42刺激后 HUVEC細(xì)胞活性及炎性因子IL－6、IL－1、TNF－α釋放關(guān)系，為白藜蘆醇用于治療AD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 HUVEC細(xì)胞株（上海拜力生物試劑有限公司）；白藜蘆醇（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：20130409，純度大于95%）；IL－1、TNF－α、IL－6ELISA 試劑盒（晶美生物工程有限公司）；Aβ1～42（北京奧普森有限公司）；CCK－8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW－CJ－1F型）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，CKX41型）；酶標(biāo)儀（美國BIO－RAD公司，550型）。

1．2 CCK－8法檢測白藜蘆醇對 Aβ1～42干預(yù)后 HUVEC細(xì)胞活性影響 將Aβ1～42在37℃孵育1周使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)備

用，HUVEC細(xì)胞株采用RPMI 1640＋10%胎牛血清＋青鏈霉素培養(yǎng)［5］。將對數(shù)生長期的 HUVEC按1×105／L接種。每個濃度3個復(fù)孔，選擇 Aβ1～425×101μmol／L刺激24h作為HUVEC細(xì)胞凋亡模型，將細(xì)胞分為模型組（Aβ1～42＋細(xì)胞），白藜蘆醇組（白藜蘆醇160、80、40、20μg／L＋ Aβ1～42＋細(xì)胞），陰性組（細(xì)胞＋培養(yǎng)基），24h后每孔加入CCK－8 10μL繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀450nm波長下檢測各孔吸光度值，以O(shè)D450值反應(yīng)細(xì)胞活力情況，連續(xù)重復(fù)3次。

1．3 ELISA法檢測白藜蘆醇對Aβ1～42干預(yù)后 HUVEC的IL－1、IL－6和TNF－α影響 將各組處理24h后取上清液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，450nm處測量OD450值。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS16．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用x±s表示，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 白藜蘆醇對Aβ1～42刺激 HUVEC后細(xì)胞活性影響 陰性組細(xì)胞活性明顯強(qiáng)于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；白藜蘆醇各亞組均可改善Aβ1～42刺激后HUVEC細(xì)胞活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見圖1。

2．2 白藜蘆醇對 Aβ1～42刺激 HUVEC的IL－1、IL－6和 TNF－α影響 與模型組比較，陰性組IL－1、IL－6和TNF－α表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。白藜蘆醇各亞組干預(yù)后可減少 Aβ1～42刺激后 HUVEC的IL－1、IL－6和TNF－α的分泌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），見表1。

表1 白藜蘆醇對 Aβ1～42刺激 HUVEC后IL－1、IL－6和TNF－α的影響（x±s，pg／mL）

圖1 白藜蘆醇對Aβ1～42刺激HUVEC后細(xì)胞活性情況

3 討 論

白藜蘆醇在腦缺血及再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病和癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治上有一定作用［6－7］。Aβ致血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡可能是產(chǎn)生AD的原因之一［8］。但Aβ如何致血管內(nèi)皮的過程與機(jī)制目前并未完全清楚，有人認(rèn)為可能與Aβ致血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等有關(guān)［9］。研究顯示Aβ聚集和沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞并產(chǎn)生TNF－α，誘導(dǎo)胞內(nèi)產(chǎn)生過多氧自由基，損傷神經(jīng)元［10］。膠質(zhì)細(xì)胞的活化還可導(dǎo)致IL－1的過度表達(dá)和釋放，繼而誘發(fā)IL－6、γ－干擾素（interferon－γ，INF－γ）等細(xì)胞因子的表達(dá)［11］，這些分子通過作用于膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，形成交互作用影響膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，促成了慢性炎癥產(chǎn)物貫穿AD病理損傷的不同階段，并在病理發(fā)展的全過程中發(fā)揮作用［12－14］。

HUVEC較為穩(wěn)定，易于實(shí)驗(yàn)操作，故本研究選擇HUVEC作為研究。CCK－8結(jié)果顯示白藜蘆醇4個濃度組可以增加Aβ刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞后存活率，減輕Aβ致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；抑制 Aβ致 HUVEC的IL－1、IL－6與TNF－α表達(dá)。

綜上所述，白藜蘆醇能提高Aβ刺激后HUVEC細(xì)胞活性，此作用可能與減少炎癥因子IL－1、IL－6與TNF－α的產(chǎn)生有關(guān)，在防治AD上有一定意義。

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