侯安然，康秀文，陳曉兵，王言理，劉克喜

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院重癥監(jiān)護室，江蘇連云港222002）

心搏驟停（sudden cardiac arrest，SCA）一直是威脅人類生命健康的重大問題［1］。隨著醫(yī)療體系的完善與心肺復(fù)蘇技術(shù)的規(guī)范化，院外及院內(nèi)的SCA患者心肺復(fù)蘇成功率得到一定的提高，但在自主循環(huán)恢復(fù)后的患者中大約仍有68%的院外和23%院內(nèi)SCA患者死于腦損傷［2］。近年來關(guān)于心肺復(fù)蘇術(shù)后全腦缺血損傷研究涉及了能量代謝異常、炎性反應(yīng)、鈣離子超載、神經(jīng)細胞凋亡等諸多方面，其中心肺復(fù)蘇術(shù)后腦組織內(nèi)炎癥瀑布效應(yīng) 備 受 關(guān) 注［3－4］。研 究 報 道 胞 外 高 遷 移 率 族 蛋 白 B1（HMGB1）表現(xiàn)炎性因子樣作用與多種炎性介質(zhì)共同參與炎性反應(yīng)［5－6］。既往研究證實，在腦出血、腦卒中及腦膜炎患者的外周血和腦脊液中HMGB1水平均顯著升高［7－9］。近年來發(fā)現(xiàn)在心肺復(fù)蘇術(shù)后患者腦脊液和血液中HMGB1水平亦顯著升高［10］。但是，對心肺復(fù)蘇術(shù)后腦組織HMGB1表達規(guī)律尚未見相關(guān)研究報道。本研究通過窒息法制備大鼠SCA模型，檢測心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠不同時間點海馬組織內(nèi)HMGB1和核轉(zhuǎn)錄因子（NF－κB）表達及其相關(guān)性，同時觀察病理形態(tài)學(xué)改變，初步探討HMGB1和NF－κB在心肺復(fù)蘇術(shù)后腦炎性損傷中的作用，為臨床治療心肺復(fù)蘇術(shù)后腦炎性損傷尋求潛在的治療新靶點。

1 材料與方法

1．1 材料 清潔級、雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～280g（徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號：蘇SCXK2010－0003）；Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根公司）；HMGB1和NF－κB PCR引物（上海生物工程公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標準、堿性磷酸酶標記山羊抗兔鼠IgG和BCIP／NBT顯色試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗大鼠 HMGB1抗體（美國Abcam公司），兔抗鼠NF－κB抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠β－actin抗體（巴傲德生物技術(shù)有限公司）；呼吸機（BW動物呼吸，上海軟隆有限公司制造）。

1．2 方法

1．2．1 分組 采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n＝6）、復(fù)蘇組（按復(fù)蘇后自由循環(huán)恢復(fù)后2、6、12、24和48h各時間點分為5亞組，n＝6）。

1．2．2 模型制備 在實驗大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL／kg麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，四肢接心電導(dǎo)聯(lián)，監(jiān)測標準肢體Ⅱ?qū)?lián)。頸部正中切口，氣管切開置管固定，接呼吸機。行右側(cè)股動、靜脈置管，動脈導(dǎo)管接壓力傳感器，顯示動脈壓波形，待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后，假手術(shù)組開始計時實驗。復(fù)蘇組繼續(xù)于呼氣末夾閉大鼠氣管導(dǎo)管制備窒息性SCA模型，并給予心肺復(fù)蘇，在自主循環(huán)恢復(fù)后開始計時實驗。初始繼續(xù)以純氧機械通氣60min，后剪斷氣管導(dǎo)管（體外留1cm供通氣），結(jié)扎股動、靜脈，縫合皮膚切口，送回鼠籠飼養(yǎng)。

1．2．3 標準 SCA判斷標準：心電圖呈室顫、停搏，收縮壓小于或等于25mm Hg。心肺復(fù)蘇標準方法：在出現(xiàn)SCA，且夾閉氣管插管8min后開放氣道，呼吸機控制通氣（純氧），頻率每分鐘80次，潮氣量6mL／kg，吸／呼比1∶2，并快速行人工胸外按壓，按壓頻率為每分鐘200次，按壓深度為大鼠胸廓前后徑1／3，同時經(jīng)股靜脈快速推注腎上腺素0．02mg／kg，必要時追加1次。主自循環(huán)恢復(fù)判斷標準：心電圖出現(xiàn)自主節(jié)律，收縮壓大于60mm Hg，持續(xù)10min以上。復(fù)蘇無效判定：持續(xù)復(fù)蘇30min無效終止搶救。大鼠補充標準：假手術(shù)組、復(fù)蘇組在留取標本之前發(fā)生死亡的，該動物的實驗數(shù)據(jù)無效，則另進行補充實驗，以滿足每個亞組實驗數(shù)據(jù)6只。

1．2．4 標本留取 假手術(shù)組大鼠操作成功20min后留取靜脈血5mL，斷頭留取腦組織。復(fù)蘇組在模型制備成功后于各時間點留取標本：麻醉后取下腔靜脈血5mL，并斷頭處死，取左側(cè)海馬，－80℃保存；取右側(cè)海馬放4%多聚甲醛固定備用。

1．2．5 光鏡下觀察海馬組織病理變化 海馬（右）常規(guī)進行HE染色。以假手術(shù)組海馬組織病理變化為參照，觀察各時間點復(fù)蘇組海馬組織病理變化。

1．2．6 RT－PCR法檢測大鼠海馬組織 HMGB1、NF－κB mRNA表達 按照RT－PCR試劑盒操作說明，HMGB1mRNA反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火59℃30s，延伸72℃60s，共進行27個循環(huán)，最后72℃延伸10min。NF－κB mRNA反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50 s，退火53℃45s，延伸72℃60s，共28個循環(huán)，最后72℃延伸8min。引物序列及PCR條件見表1。擴增的PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，Quantity One分析軟件進行分析，以目的基因／GAPDH為本基因表達的相對值。

表1 RT－PCR引物序列及條件

1．2．7 Western Blot檢測大鼠海馬組織 HMGB1、NF－κB表達按照RIPA裂解液說明書提取蛋白，BCA法定量蛋白，配制12%分離膠，5%濃縮膠，樣品上樣量為5μL（約30μg），80V下電泳30min，120V下電泳至溴酚藍到膠底，轉(zhuǎn)膜300mA（60min），室溫下封閉90min，加一抗4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗 （1∶1 000）室溫下孵育90min，洗膜、BCIP／NBT顯色。掃描后將目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白（β－actin）條帶吸光度比值以x±s表示。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析處理。計量資料用x±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組計量資料間的多重比較采用LSD－q檢驗；若方差不齊采用隨機區(qū)組設(shè)計的秩和檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 海馬組織病理切片結(jié)果 假手術(shù)組神經(jīng)細胞排列整齊，形態(tài)完好，圓形或橢圓形，核染色較淡，染色質(zhì)分布較均勻，尼氏體分布正常，未見細胞腫脹及變性壞死等病理改變。復(fù)蘇組海馬組織存在缺血性病理改變，隨著自主循環(huán)恢復(fù)延長光鏡下細胞周圍間隙出現(xiàn)增寬，形態(tài)不規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)水腫，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，尼氏體邊聚或消失，核固縮，神經(jīng)細胞出現(xiàn)變性壞死，以自主循環(huán)恢復(fù)后24h最為顯著，自主循環(huán)恢復(fù)后48h水腫減輕，但損傷仍較重，間質(zhì)膠質(zhì)纖維增多，見圖1。

2．2 大鼠海馬組織 HMGB1、NF－κB mRNA表達變化 與假手術(shù)組比較，復(fù)蘇組自主循環(huán)恢復(fù)后2、6、12、24和48h的海馬HMGB1、NF－κB mRNA表達量均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），其中24h為峰值（P＜0．01），在48h略下降（P＜0．01），見圖2。

2．3 大鼠海馬組織HMGB1、NF－κB蛋白表達變化 與假手術(shù)組比較，海馬組織HMGB1在復(fù)蘇組自主循環(huán)恢復(fù)后2h蛋白表達顯著降低（P＜0．01），24h達到峰值（P＜0．01），48h稍下降（P＜0．01）。與假手術(shù)組比較，復(fù)蘇組自主循環(huán)恢復(fù)后2、6、12、24和48h的NF－κB蛋白表達量均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），其中24h為峰值（P＜0．01），48h略下降（P＜0．01），見圖3。

2．4 HMGB1和NF－κB蛋白表達間的相關(guān)性分析 復(fù)蘇組各時間點海馬組織HMGB1與NF－κB蛋白表達趨勢相同，相關(guān)性分析顯示二者呈正相關(guān)（r＝0．978，P＝0．000）。

圖1 各組海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE×400）

圖2 各組海馬組織 HMGB1、NF－κB mRNA表達比較

圖3 各組海馬組織HMGB1、NF－κB蛋白表達比較

3 討 論

HMGB1是一種高度保守的非組DNA結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細胞胞核，參與基因轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等多種生物學(xué)過程。近年來研究表明胞內(nèi)HMGB1釋放到胞外則作為一種炎性因子在炎性反應(yīng)瀑布中處于核心地位，在啟動早期炎性反應(yīng)、擴大和維持晚期炎性反應(yīng)過程中均發(fā)揮重要作用［11］。又有研究表明HMGB1作為一種重要的炎癥因子在腦梗死病情發(fā)展轉(zhuǎn)歸過程中能激活其他炎癥介質(zhì)，放大炎性反應(yīng)，加劇腦損傷［12］。

本研究顯示心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠海馬組織HMGB1蛋白表達水平于2h降低，而后逐漸上升，24h達到高峰，在48h略下降，但仍高于正常水平。本研究與 Wang等［13］報道類似，但不同之處為本研究自主循環(huán)恢復(fù)后2hHMGB1蛋白表達量降低，而Wang等［13］研究則為2h時升高，原因可能為制作動物模型方式不同和缺血時間長短不同。SCA所致為全腦缺血缺氧，其缺血面積及損傷程度更為顯著，在心肺復(fù)蘇術(shù)后早期階段，神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞等出現(xiàn)缺血受損或壞死，HMGB1迅速從胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)被動釋放至胞外、耗竭，而后釋放出來的HMGB1進一步激活小膠質(zhì)細胞和其他免疫細胞主動分泌HMGB1、炎性因子共同介導(dǎo)心肺復(fù)蘇術(shù)后腦炎性損傷。從而出現(xiàn)心肺復(fù)蘇術(shù)后海馬組織HMGB1表達呈現(xiàn)明顯的早期降低、晚期升高的趨勢，有關(guān)研究也得到類似觀點［14］。以上研究均提示HMGB1是觸發(fā)心肺復(fù)蘇術(shù)后腦缺血早期炎性反應(yīng)的上游始動因子。HMGB1基因表達呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，在48h略下降，與蛋白表達趨勢類似。

NF－κB是一種功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，基礎(chǔ)狀態(tài)下主要存在于真核細胞胞質(zhì)，在活化因素的激活下可迅速從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核與相應(yīng)的DNA結(jié)合位點特異性結(jié)合，隨后啟動、調(diào)控炎性因子的表達，造成組織損傷。然而升高的炎性因子反過來可充當(dāng)活化因素再次激活NF－κB形成一種正反饋途徑不斷地促進炎癥的發(fā)生、發(fā)展，可見NF－κB是炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。腦缺血能誘導(dǎo)NF－κB的激活，激活的NF－κB在腦缺血無菌性炎性損傷［15］、腦水腫、神經(jīng)細胞凋亡等方面均發(fā)揮著重要作用。本研究得出NF－κB在心肺復(fù)蘇術(shù)后海馬組織蛋白表達隨著自主循環(huán)恢復(fù)時間延長逐漸上升，24h為峰值，后緩慢下降，其基因表達與蛋白表達一致，與 Wang等［13］的研究結(jié)果一致。NF－κB與HMGB1蛋白表達相關(guān)性分析顯示二者呈顯著正相關(guān)（r＝0．978，P＝0．000）。HE染色觀察大鼠心肺復(fù)蘇術(shù)后腦缺血病理改變與海馬組織中HMGB1、NF－κB表達變化趨勢基本一致，從病理形態(tài)學(xué)方面支持以上結(jié)論。另外研究發(fā)現(xiàn)胞外的HMGB1可與受體RAGE、TLR2／4等結(jié)合通過不同信號通路介導(dǎo) NF－κB活化［16］。以上提示 HMGB1位于 NF－κB上游，進而推測在心肺復(fù)蘇術(shù)后早期由受損、壞死的細胞被動釋放的HMGB1是啟動心肺復(fù)蘇術(shù)后早期腦炎性反應(yīng)的主要炎性因子。綜上所述，HMGB1和NF－κB在心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠海馬組織中變化趨勢一致，并且二者之間呈顯著正相關(guān)性，表明HMGB1／NF－κB信號通路可能參與了心肺復(fù)蘇術(shù)后早期腦炎性損傷，進而加劇腦組織損害。若在此時間窗內(nèi)給予針對HMGB1／NF－κB信號通路的靶向治療有望減輕心肺復(fù)蘇術(shù)后腦炎性損傷、改善神經(jīng)功能預(yù)后。但本研究仍需延長觀察時間，擴大樣本量，設(shè)計通道“分子開關(guān)”做進一步地研究探索、證實。

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