程永波，郭麗萍，王 磊，房殿春△

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊830054；2．第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400038）

一般認(rèn)為，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶多表達(dá)于絕大部分癌細(xì)胞和少數(shù)正常高增殖細(xì)胞如造血干細(xì)胞、基底表皮細(xì)胞等，正常成熟細(xì)胞尤其是成纖維細(xì)胞檢測(cè)不到hTERT和端粒酶活性［1－3］。但近年來一些研究證實(shí)hTERT和端粒酶在成人成纖維細(xì)胞中有表達(dá)［2－4］，以往的研究也證實(shí)了hTERT和端粒酶可以在成人胃成纖維細(xì)胞中表達(dá)［5］。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，作者初步檢測(cè)了hTERT和端粒酶在人胎胃成纖維細(xì)胞的表達(dá)，以期彌補(bǔ)有關(guān)研究的不足。

1 材料與方法

1．1 材料 膠原酶Ⅱ（Sigma），分散酶（Roche）；Ham F12培養(yǎng)液和胎牛血清（GIBCO），培養(yǎng)皿（Corning）；端粒酶檢測(cè)試劑盒（北京鼎國(guó)），hTERT兔抗人一抗、TRITC標(biāo)記羊抗兔二抗

（中杉金橋），CK－18小鼠抗體和FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；DAPI（Vector Laboratories）。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)過學(xué)校、醫(yī)院倫理委員會(huì)和人流者同意，由引產(chǎn)死胎取胎胃，3個(gè)月胎齡。采用磁性攪拌酶分離法分離細(xì)胞［6］，接種于塑料培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)。CK－18免疫細(xì)胞化學(xué)染色排除上皮細(xì)胞。

1．3 hTERT免疫細(xì)胞化學(xué)觀察 細(xì)胞固定、透膜處理后一抗4℃孵育13h，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗常溫避光孵育40min，DAPI核染色后封片，Leica TCS SP5激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1．4 端粒酶活性檢測(cè) 采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）。上游引物：5′－ATT CCG TCG AGC AGA GTT－3′，下游引物：5′－CCC TTA CCC TTA CCC TAA－3′（FITC標(biāo)記）。步驟：細(xì)胞消化后離心，提取蛋白；取蛋白上清、上游引物與PCR反應(yīng)液20℃溫育40min，90℃3min滅活端粒酶。加入下游引物和Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。聚丙烯酰胺凝膠電泳3h。以熱處理后的蛋白上清作為陰性對(duì)照，已證明有端粒酶活性的成人胃成纖維細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室有凍存）作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)對(duì)二者的端粒酶活性作比較。ABIPrism 377測(cè)序儀分析膠圖。

2 結(jié) 果

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞分離后，培養(yǎng)到第9天可見成片成纖維細(xì)胞，CK－18免疫染色陰性，見圖1。

2．2 hTERT表達(dá) 原位監(jiān)測(cè)胎胃成纖維細(xì)胞hTERT表達(dá)呈陽(yáng)性，胞質(zhì)和胞核中均可見細(xì)顆粒狀FITC紅色熒光，陰性對(duì)照胞質(zhì)和胞核中都未見熒光，見圖2。

2．3 端粒酶活性 胎胃成纖維細(xì)胞可觀察到端粒酶延伸的端粒片斷，長(zhǎng)度約為170bp，略高于與陽(yáng)性對(duì)照組成人胃成纖維細(xì)胞（160bp），陰性對(duì)照未見延伸的端粒片斷，見圖3。

圖1 人胎胃成纖維細(xì)胞形態(tài)和CK－18免疫染色（×100）

圖2 人胎胃成纖維細(xì)胞hTERT表達(dá)

圖3 人胎胃成纖維細(xì)胞端粒酶活性

3 討 論

端粒酶可以通過延伸端粒長(zhǎng)度使細(xì)胞避免老化和死亡，因此其多與細(xì)胞增殖有關(guān)。95%以上的癌細(xì)胞不同程度地表達(dá)端粒酶［7］，正常體細(xì)胞中少數(shù)增生能力強(qiáng)的如滋養(yǎng)層細(xì)胞、造血干細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等也可檢測(cè)到端粒酶活性。端粒酶的組分之一hTERT表達(dá)是端粒酶活性的限速步驟，其表達(dá)水平和端粒酶的活性高低基本平行［8－10］。成纖維細(xì)胞是一種多形性細(xì)胞，是機(jī)體組織的主要修復(fù)細(xì)胞。在靜息狀態(tài)下其增生較弱或不增生，被稱為纖維細(xì)胞，但在組織損傷修復(fù)過程中則表現(xiàn)出多種功能活性，增殖便是其中之一［11］。在這一階段，檢測(cè)到hTERT和端粒酶表達(dá)是和上述理論相符合的。成纖維細(xì)胞的離體培養(yǎng)，實(shí)際上也是一個(gè)不斷分裂增殖的過程，理論上也應(yīng)該有hTERT和端粒酶表達(dá)，不管是成人還是胎兒的，都應(yīng)如此，這在既往［5］和現(xiàn)在的研究中也得到了證實(shí)。在實(shí)際操作中，從光鏡下形態(tài)學(xué)和hTERT細(xì)胞免疫結(jié)果看胎胃和成人胃成纖維細(xì)胞分裂增殖能力無明顯差別，但從端粒酶的延伸片斷長(zhǎng)度看，前者要略長(zhǎng)于后者，說明前者的增生能力要強(qiáng)于后者，這也符合常理。

成纖維細(xì)胞在組織創(chuàng)傷、炎癥后的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，但在修復(fù)過程中，若成纖維細(xì)胞過度增殖則會(huì)引起一些病理性變化如皮膚瘢痕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特征性血管翳等；其他如肺纖維化、肝硬化、心瓣膜病等都與成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)［11］。以往和現(xiàn)在的研究采用成人和胎胃成纖維細(xì)胞為工具，證實(shí)它們都表達(dá)hTERT和端粒酶，這為成纖維細(xì)胞合理修復(fù)的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)；另外，也為除細(xì)胞因子外，從hTERT和端粒酶為切入點(diǎn)預(yù)防成纖維細(xì)胞修復(fù)過程中的弊端提供了一種新的思路。

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