韓 勇，郭立榮，孔德營，蔣 慧，田 虹

（遵義醫(yī)學(xué)院：1．生理學(xué)教研室；2．形態(tài)學(xué)實驗室，貴州遵義563000）

20－羥二十烷花生四烯酸（20－HETE）是 Capdevila等［1］學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)在肝臟組織中由細胞色素P－450催化花生四烯酸（AA）生成的內(nèi)源性活性物質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)以來得到了心血管領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注，目前研究認為20－HETE是調(diào)節(jié)腎、腦等小動脈血管緊張度的重要因子［2－4］。但其對心臟功能的影響研究甚少，有學(xué)者［5－6］在心肌缺血再灌注損傷的研究中，發(fā)現(xiàn)冠狀血管內(nèi)細胞色素P－450催化AA的代謝產(chǎn)物20－HETE生成明顯增加，表明20－HETE參與心肌缺血再灌注進程中，但其作用機制尚未完全闡明。大量的研究表明活性氧簇（ROS）是引起心肌缺血再灌注的主要啟動因子［7－8］，但在心肌缺血再灌注中ROS被激活及生成的分子機制尚待深入研究。因此，本研究的目的是在大鼠離體心臟上探究心肌缺血再灌注中20－HETE對心肌功能及ROS生成的影響，探究20－HETE加重心肌缺血再灌注的可能機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物分組及試劑 雄性Wistar大鼠（220±20）g 60只，缺血再灌注對照組為A組，缺血再灌注＋HET0016（20－HETE合成酶抑制劑）組為B組、缺血再灌注＋20－HETE（10、30、50nmol／L）組為C、D、E組，每組12只。20－HETE購于美國Sigma－Aldrich公司，HET0016購于美國Cayman公司；ROS檢測試劑盒及蛋白質(zhì)過氧化檢測試劑盒購于南京建成生物制品公司；全蛋白提取試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；肌酸激酶（CK）檢測試劑盒購于四川邁克科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 建立模型 大鼠麻醉后，開胸取出心臟置于4℃ KH液中修剪，迅速將主動脈套管后置于Langendorff心肌灌流系統(tǒng)上，37℃下使用 KH 液（NaCl 118．0mmol／L，NaHCO325．0 mmol／L，KCl 4．7mmol／L，KH2PO41．2mmol／L，MgSO4·7H2O 1．2mmol／L，CaCl22．0mmol／L，葡萄糖11．0mmol／L）進行主動脈逆行灌流。大鼠左心室插入一個充水小球囊，另一端連接到壓力傳感器監(jiān)測心室內(nèi)壓變化。使用Powerlab／8P系統(tǒng)連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓（LVDP），左心室舒張末期壓（LVEDP），左心室最大收縮速率、最大舒張速率（±dp／dtmax）。定時收集灌流液測定冠狀動脈流量（CF），并使用日立HITACHI 7060全自動化分析儀（DGKC法）檢測CK水平。

1．2．2 心肌缺血再灌注實施方案 37℃條件下，離體心臟缺血前灌流20min平衡，然后全心缺血35min，再灌注15min后檢測ROS水平，或再灌注40min后用于檢測生化指標(biāo)，或再灌注120min用以檢測心肌梗死面積。測定缺血前及再灌注后的左心室功能及血流動力學(xué)變化。

1．2．3 心肌梗死面積測定 心臟再灌注后，－20℃下冷凍1 h，切片（2～3mm）放入含有1%TTC的磷酸鹽緩沖液中，37℃條件下孵育15min染色，10%甲醛固定。梗死區(qū)通過測定染色區(qū)域（紅色，存活組織）和非染色區(qū)域（白色，壞死組織）面積占全部左心室面積比值后進行比較。

1．2．4 心肌ROS水平測定 ROS的生成使用對氧敏感的熒光探針DHE法測定，離體心臟再灌注15min后，剪成小塊（100mm3）置入組織包埋劑中，液氮冷凍，冰凍切片（10μm）后置于載玻片上，然后將切片在PBS緩沖液中使用DHE（1．6 μmol／L）37℃避光孵育30min，激光共聚焦顯微鏡下在488 nm激發(fā)光，560～660nm濾波接收，獲取熒光照片。

1．2．5 蛋白質(zhì)過氧化水平檢測 蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的重要標(biāo)記，羰基的水平基于羰基與2，4－二硝基苯肼（DNPH）反應(yīng)生成二硝基苯腙進行測定，心臟再灌注后，提取心肌組織蛋白（1mg／mL），100μL加入500μL DNPH（10mmol／L）室溫孵育60min，20%三氯乙酸沉淀蛋白，蛋白沉淀物使用1∶1乙醇和乙酸乙酯洗脫3次后，使用6 mol的鹽酸胍重懸浮蛋白，370nm下檢測吸光度。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS15．0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗方法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 20－HETE對缺血再灌注后心肌力學(xué)的影響 離體心臟灌流平衡20min，全心缺血35min，再灌注40min，應(yīng)用Powerlab／8P系統(tǒng)連續(xù)實時記錄各組心臟血流動力學(xué)功能改變，再灌注末期各組心臟心肌收縮力均明顯下降，如圖1A所示。在心肌缺血再灌注進程中，當(dāng)使用HET0016減少內(nèi)源性20－HETE生成后，顯著改善了再灌注后心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的恢復(fù)，其中 LVDP由 A 組（48．6±3．4）%升高至（71．6±3．5）%，LVEDP由（41．8±3．3）%降低至（32．1±4．5）%，而±dP／dtmax分別由（51．9±2．1）%恢復(fù)至（69．0±3．2）%及（47．1±3．6）%升至（64．1±3．7）%。而外源性加入20－HETE后，劑量依賴性地加重了缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌血流動力學(xué)指標(biāo)的下降，其中E組心肌血流動力學(xué)指標(biāo)顯著下降（P＜0．05）；LVDP由 A組（48．6±3．4）%下降至（24．1±7．4）%，LVEDP由（41．8±3．3）%升至（76．0±4．7）%，±dP／dtmax分別由（51．9±2．1）%降至（29．2±6．3）%及（47．1±3．6）%降至（26．2±7．9）%，見圖1B～D。

2．2 20－HETE對缺血再灌注后CF及CK釋放的影響 再灌注末期與A組比較，B組心臟的CF由（6．0±1．1）mL／min升至（8．2±1．3）mL／min，CK 由（331．0±12．0）U／L 降低至（198．7±11．2）U／L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。E組CF由（6．0±1．1）mL／min降低至（4．5±0．7）mL／min，CK 由（331．0±12．0）U／L升至（660．0±21．0）U／L，見圖2。

2．3 20－HETE對缺血再灌注后心肌梗死面積的影響 離體心臟灌流20min，然后全心缺血35min，再灌注120min后，通過TTC染色法檢測心肌梗死面積。與A組比較，B組心臟的梗死面積顯著減少（P＜0．05），由（39．8±2．3）% 降低至（29．6±2．4）%。而外源性加入20－HETE各組，劑量依賴性地增加了再灌注后心肌梗死面積（P＜0．05），其中E組心肌梗死面積達到了（58．1±4．1）%，見圖3。

2．4 20－HETE對缺血再灌注后心肌組織ROS生成的影響

B組熒光強度為72．0±5．1明顯低于A組的105．0±3．5，而E組的熒光強度為145．0±7．3顯著高于 A組（P＜0．05），見圖4。

圖1 20－HETE對心肌缺血再灌注后心肌力學(xué)的影響

圖2 20－HETE對缺血再灌注后CF及CK釋放的影響

2．5 20－HETE對缺血再灌注后心肌組織蛋白質(zhì)過氧化的影響 與A組相比，使用HET0016處理后降低了蛋白質(zhì)的羰基化作用（P＜0．05），E組則顯著增強了蛋白質(zhì)的羰基化作用（P＜0．05），見圖5。

圖3 20－HETE對再灌注后心肌梗死面積的影響

圖4 20－HETE對再灌注后心肌組織ROS生成的影響

圖5 20－HETE對再灌注后心肌組織蛋白質(zhì)羰基化作用

3 討 論

經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)和冠狀動脈內(nèi)支架是臨床治療急性心肌梗死常用的治療手段［9］，但是缺血一定時間的心肌組織在恢復(fù)血液灌注后，卻伴發(fā)嚴(yán)重心律失常和心肌功能紊亂，甚至導(dǎo)致致命性的并發(fā)癥，即缺血再灌注損傷［10－11］，如何減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷是臨床治療缺血性心肌病的重要問題。

有研究報道發(fā)現(xiàn)20－HETE參與了腎和腦缺血導(dǎo)致的損傷［12－13］，在心肌缺血再灌注損傷中也有研究發(fā)現(xiàn) 20－HETE水平明顯增加，心肌組織中CYP450ω－羥化酶表達和活性顯著增強［5－6］，表明20－HETE參與到了心肌缺血再灌注損傷當(dāng)中，但機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷進程中，應(yīng)用HET0016來減少內(nèi)源性20－HETE生成后，改善了由于缺血再灌注導(dǎo)致的心肌功能下降，再灌注結(jié)束時與A組相比，LVDP、＋dP／dt、－dP／dt分 別 升 高 了 47．3%、32．9% 和36．0%，CF增加了36．7%，LVEDP降低了23．2%，同時減少了CK釋放40．0%，并降低了心肌梗死面積34．5%。而外源性20－HETE（50nmol／L）顯著降低了缺血后心肌功能的恢復(fù)，與A組相比，LVDP、＋dP／dt、－dP／dt分別降低了50．4%、43．7%和44．4%，CF減少了25．0%，LVEDP升高了81．8%，同時增加了CK釋放99．4%，并導(dǎo)致心肌梗死面積增加了46．0%。這些數(shù)據(jù)明確表明20－HETE具有加重心肌缺血再灌注損傷的作用，這與之前的學(xué)者研究一致。然而，20－HETE加重心肌缺血再灌注損傷、降低心肌功能的機制尚需進一步探究。

ROS在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機理中起到至關(guān)重要的作用，減少ROS的生成可顯著改善缺血再灌注后心肌功能的恢復(fù)，減少心肌梗死面積［14］，被認為是引起缺血再灌注損傷的主要啟動因子［7－8］，而由于心臟中缺乏抗氧化酶，對于ROS的敏感性要高于其他組織器官。另外，有研究表明在肝細胞中CYP450可促進ROS生成，參與多種疾病的發(fā)生，如帕金森疾病、糖尿病等［15］。因此，作者首先檢測了在心肌缺血再灌注損傷進程中CYP450酶代謝產(chǎn)物20－HETE對ROS生成的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用HET0016選擇性抑制CYP450酶家族中CYP4A和4F的ω羥基化作用［16］，減少內(nèi)源性20－HETE的合成后，與A組相比，B組心臟再灌注后ROS的生成減少了31．4%，而外源性加入20－HETE（50nmol／L）心臟中 ROS生成增加了38．0%，表明在心肌缺血再灌注損傷中20－HETE有明顯的促進ROS過量生成的作用。

心肌細胞內(nèi)過量的ROS可以損傷亞細胞組分，并造成蛋白質(zhì)過氧化損傷。有研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血后與心肌收縮相關(guān)的肌鈣蛋白［17］及肌動蛋白［18］均發(fā)生過氧化損傷，影響缺血后的心肌的功能。其他相關(guān)研究也支持該結(jié)論，在不同的生理病理條件下，過量生成的ROS可導(dǎo)致心肌收縮功能的紊亂。ROS可使蛋白質(zhì)賴氨酸、精氨酸、脯氨酸等殘基氧化生成羰基化蛋白產(chǎn)物［19］，而蛋白羰基化水平是反應(yīng)ROS介導(dǎo)的蛋白氧化損傷的主要檢測指標(biāo)［20］。所以本研究接下來檢測了再灌注后心肌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化水平的改變，研究發(fā)現(xiàn)與A組心臟相比，再灌注后B組心臟中蛋白質(zhì)羰基化水平降低了34．7%，而外源性加入20－HETE（50nmol／L）中蛋白質(zhì)羰基化水平顯著升高51．1%。如上研究結(jié)果表明在心肌缺血再灌注損傷進程中，20－HETE通過促進ROS的生成增多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過氧化損傷，最終加重心肌再灌注后的功能損傷。

綜上研究，作者發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注損傷進程中，抑制內(nèi)源性20－HETE的生成可明顯改善心肌功能的恢復(fù)和減少梗死面積的發(fā)生，而外源性加入20－HETE則顯著加重再灌注后的心肌損傷，其機制是在該進程中20－HETE誘導(dǎo)過量ROS的生成，導(dǎo)致收縮相關(guān)蛋白氧化損傷，為臨床治療缺血性心肌病提供了一定的理論依據(jù)。

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