饒桂榮，張換敬，黃 彬，陳光明，王洪敏，楊富強

HBV感染慢性化的發(fā)生除HBV本身的生物學特性外，更重要的是取決于機體的免疫應答狀態(tài)，因此建立一種不僅能預防HBV感染，更能有效免疫清除肝細胞內(nèi)病毒的治療性疫苗，是當今這一醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點和難點[1-3]。治療性DNA疫苗的作用機制是通過產(chǎn)生內(nèi)源性抗原提高機體特異性細胞免疫，打破患者免疫耐受狀態(tài)以清除病毒，該種疫苗是穩(wěn)定、安全、有效的理想疫苗之一[4-5]。

基因載體的選擇對DNA疫苗至關(guān)重要，一方面，標準質(zhì)粒的骨架DNA成分均包括DNA復制起始位點及抗菌素抵抗基因等，這些成分會抑制目的基因表達，并且載體基因DNA可能插入宿主基因組，誘發(fā)插入突變和基因沉默的危險；另一方面，標準質(zhì)粒轉(zhuǎn)導效率低，目的基因只能實現(xiàn)瞬間表達，其分子量較大，容易引發(fā)免疫反應而被機體所清除。因此，安全、高效的表達是研究核酸DNA疫苗基因治療的關(guān)鍵[6]。Chen等[7]和Kay等[8]開發(fā)的微環(huán)DNA載體技術(shù)有助于解決以上問題。微環(huán)是一種環(huán)狀表達盒子，不含標準質(zhì)粒中細菌骨架DNA，能在體內(nèi)長期表達高水平的目的基因產(chǎn)物。微環(huán)在結(jié)構(gòu)、基因表達的持久性和細胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價閉環(huán)DNA相同，使微環(huán)成為安全、高效的理想載體之一。微環(huán)DNA的制備方法是將含目的基因的親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖誘導重組酶的表達，重組酶介導其識別位點發(fā)生重組，使親本質(zhì)粒重組形成含細菌骨架的質(zhì)粒和含目的基因表達盒的微環(huán)DNA[9]。而宿主菌體內(nèi)聯(lián)合表達I－SceⅠ內(nèi)切酶可將含細菌骨架的質(zhì)粒酶切為線性DNA，繼而被降解掉，再采用常規(guī)質(zhì)粒提取分離方法即可獲得高純度的微環(huán)DNA。本文構(gòu)建了HBV的微環(huán)DNA質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF，通過細胞轉(zhuǎn)染獲得目的基因的高表達，并聯(lián)合在體電脈沖（electroporation,EP）技術(shù)注射健康小鼠以檢測到雙質(zhì)粒疫苗的特異性免疫效果，旨在為慢性HBV感染者DNA疫苗治療研究的進一步應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；pfu聚合酶和T4 DNA連接酶等均購自日本Takara公司；COS－7細胞為本實驗室保存；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；“立可讀”乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自美國Qiagen公司；Mouse IFNγELISPOT Kit購自BD公司；植物凝血素（PHA）、淋巴細胞分離液和牛血清蛋白均購自美國Sigma公司。

1.2 質(zhì)粒和菌株 重組質(zhì)粒preS2.S/pcDNA3.1和hIL－2－IFN γ/pcDNA3.1 由本實驗室構(gòu)建和保存[10]；ZY781載體[7]和大腸桿菌ZYCY10P3S2T[8]由中國科學院深圳先進技術(shù)研究院陳志英教授饋贈；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1.3 主要試劑配制 培養(yǎng)液：將蛋白胨12 g、酵母提取物24 g和甘油4ml溶解在900ml水中，待各組分溶解后高壓滅菌，冷卻至60℃，再加入100ml經(jīng)高壓滅菌或用0.22μm濾膜過濾的170mmol/L KH2PO4和 0.72mol/L K2HPO4的混合液即得；Minicle Induction Mix：向 100ml LB（Lysogeny broth）中加入1mol/L的NaOH 4ml和20%的阿拉伯糖200μl，混合后經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

1.4 引物設(shè)計和PCR擴增目的片段 基于重組質(zhì)粒preS2.S/pcDNA3.1和hIL－2－IFNγ/pcDNA3.1的序列，在目的基因的增強子上游和polyA下游設(shè)計引物，用于擴增含有目的基因及其上下游的增強子、啟動子和polyA調(diào)控序列的DNA片段。設(shè)計的引物序列 F:5'－GAA GAT CTG GCG GGT TGA GAT TGA TTA TTG AGT AG －3'，R:5'－ACG CGT CGA CCGATAGAGCCCACCGGA T－3'。以質(zhì)粒 preS2.S/pcDNA3.1和 hIL－2－IFNγ/pcDNA3.1為模板，分別進行以下 PCR 反應：25μl體系中含 10×buffer2.5μl、dNTP（2.5mM）2 μl、上游引物（10pM）0.5 μl、下游引物（10pM）0.5 μl、模板 5 μl、DNA 聚合酶（2.5 U/μl）0.4μl、雙蒸水 14.1μl。PCR 擴增程序：95℃ 5min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃5min。

1.5 親本質(zhì)粒的構(gòu)建及重組成微環(huán)DNA 回收PCR目的產(chǎn)物后，使用BglⅡ和SalⅠ雙酶切目的片段和ZY781載體。按常規(guī)方法將目的片段分別克隆至載體ZY781的多克隆位點上，即得親本質(zhì)粒preS2.S/ZY781和 hIL－2－IFN γ/ZY781。轉(zhuǎn)化大腸桿菌ZYCY10P3S2T并進行液體培養(yǎng)擴增。經(jīng)酶切鑒定和測序確定插入片段序列正確后，進行以下親本質(zhì)粒重組成微環(huán)DNA的操作：按0.25‰的接種量分別將上述菌液接入含50μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)液中，37℃，250 r/min過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的菌液Minicle Induction Mix按等體積混合，于32℃250 r/min反應5 h，必要時可延長反應1～3 h。離心收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（Takara miniBEST Plasmid Purification kit ver 4.0,Code No.9760）提取質(zhì)粒，即為微環(huán)DNA質(zhì)粒。

1.6 微環(huán)質(zhì)粒體外細胞轉(zhuǎn)染 按常規(guī)方法培養(yǎng)COS－7細胞株，用胰蛋白酶消化貼壁細胞，重懸于含血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，按3×105個/孔接種于6孔板上，于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h。待細胞融合度達90%～95%，分別取4μg pMCS2.S質(zhì)粒，參照 Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染，每個質(zhì)粒做2個平行孔，同時設(shè)無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞組、空載體組為對照。繼續(xù)培養(yǎng)，并于24、48、72 h時收集上清，按HBV表面抗原試劑盒和人白細胞介素（interleukin,IL）－2和干擾素（interferon,IFN）γ檢測試劑盒定量目的基因的表達水平。

1.7 EP輔助雙微環(huán)質(zhì)粒免疫健康的BALB/c小鼠 健康的 BALB/c小鼠 50只，18～20 g，4～6周齡，SPF級，隨機分組，每組10只。第1組為空載體（10μg/只）組，第 2組為微環(huán)質(zhì)粒 pMCS2.S（10μg/只）組，第 3組為微環(huán)雙質(zhì)粒 pMCS2.S┼pMCIIF（5μg/只┼5μg/只）組，第 4組為微環(huán)雙質(zhì)粒pMCS2.S┼pMCIIF（10μg/只┼10 μg/只）組，同時設(shè)0.9%氯化鈉溶液對照組。采用EP技術(shù)在小鼠雙側(cè)脛前肌注射。分別在接種的第2、4周采用眼球后靜脈叢穿刺法采血，以3000 r/min離心10 min分離血清并于－20℃保存，待最后一次性ELISA檢測HBsAb水平，計算抗體出現(xiàn)的陽性小鼠數(shù)。接種4周后，處死小鼠取脾臟分離淋巴細胞進行酶聯(lián)免疫斑點檢測（enzyme－linked immunospotassay,ELISPOT）實驗。ELISPOT檢測嚴格按BD公司試劑盒使用說明書方法操作。判斷標準：①同一細胞密度條件下，ELISPOT檢測板中同一樣品的HBsAg刺激與非HBsAg刺激的各3個復孔斑點形成細胞（spot forming cell,SFC）均數(shù)的比值應不小于2；②制劑免疫組樣品淋巴細胞密度為3×105/孔檢測時，HBsAg刺激與非HBsAg刺激各3個復孔SFC均數(shù)的差值不小于5，符合以上其中1項為陽性。以此標準作為小鼠特異性細胞免疫的陽性評價標準，實驗組小鼠的細胞免疫應答陽性率應不低于60%。

1.8 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間率的比較用Fisher確切概率法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 親本質(zhì)粒 preS2.S/ZY781和 hIL-2-IFNγ/ZY781的構(gòu)建及重組成微環(huán)DNA 構(gòu)建流程見圖1和圖2，由親本質(zhì)粒preS2.S/ZY781重組成微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S，由親本質(zhì)粒hIL-2-IFNγ/ZY781重組成微環(huán)質(zhì)粒pMCIIF。2種親本質(zhì)粒重組后大小均從約6.0 kbp變成約2.5 kbp，經(jīng)酶切后均出現(xiàn)約2 kbp和4 kbp兩條特異目的條帶，說明親本質(zhì)粒酶切鑒定正確，并成功重組生成微環(huán)質(zhì)粒。結(jié)果見圖3。

圖1 微環(huán)質(zhì)粒DNA構(gòu)建流程Figure 1 Construction process ofm inicircle DNA

圖2 微環(huán)質(zhì)粒的重組生成過程Figure 2 Generation ofm inicircle DNA

圖3 質(zhì)粒及酶切電泳圖譜1.DL2000；2.Vector ZY 781；3.pMCS2.S；4.preS2.S/ZY781；5.pMCS2.S被BglⅡ和 SalⅠ雙酶切；6.preS2.S/ZY781被 BglⅡ和 SalⅠ雙酶切；7.pMCIIF；8.hIL-2-IFN γ/ZY781；9.pMCIIF 被 BglⅡ和SalⅠ雙酶切；10.hIL-2-IFN γ/ZY781被 BglⅡ和SalⅠ雙酶切Figure 3 Identification of double m inicircle plasm ids digested by the restriction enzymes

2.2 微環(huán)質(zhì)粒細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF轉(zhuǎn)染到COS-7細胞后，于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h分別收集細胞上清液，如圖4所示，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染24 h后即有目的基因的表達；在48 h時，HBsAg、IL-2和IFNγ表達水平為最高，分別為 （60.3±7.8）、（17.7±1.9）、（10.3±0.9）ng/ml；72 h時，這些目的蛋白的表達量呈下降趨勢，且無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞對照組均未檢測到目的產(chǎn)物。

圖4 微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF的在COS-7細胞轉(zhuǎn)染表達結(jié)果Figure 4 Protein expression of double m inicircles DNA(pMCS2.S and pMCIIF)transfected into COS-7

2.3 微環(huán)質(zhì)粒對BALB/c小鼠的初步免疫效果 血清HBsAb≥10m IU被認為是機體保護性有效濃度。實驗結(jié)果顯示，0.9%氯化鈉溶液組和空載體組的小鼠血清HBsAb濃度＜10m IU，ELISA結(jié)果為陰性；pMCS2.S和pMCS2.S┼pMCIIF不同劑量組均能在2周即可部分誘導小鼠HBsAb產(chǎn)生，4周后產(chǎn)生更強的免疫反應，pMCS2.S聯(lián)合佐劑pMCIIF效果更顯著，10只小鼠血清HBsAb均陽性，差異有統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表1，具體含量見表2。4周時取小鼠脾淋巴細胞進行特異性IFNγELISPOT實驗以檢測特異性細胞免疫應答。計算每組刺激孔和無刺激孔的斑點數(shù)，當無刺激點數(shù)＞5時，刺激孔點數(shù)/無刺激點數(shù)≥2，判定為陽性;當無刺激點數(shù)≤5時，刺激孔點數(shù)－無刺激點數(shù)≥5，判定為陽性。經(jīng)以上計算，最終得到每組IFNγSFC斑點數(shù)。見圖5。

表1 小鼠免疫后血清HBsAb及ELISPOT檢查結(jié)果（只）Table 1 Positive ratio of HBsAb ELISA and specific IFN γELISPOT after immunization(numbers)

表2 小鼠免疫后血清HBsAb濃度（10 m IU）及特異性IFN γELISPOT實驗結(jié)果（x±s）Table 2 Concentration of HBsAb(10 m IU)and SFC of specific IFN γ ELISPOT after immunization （x±s）

3 討 論

HBV在全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是嚴重危害人類健康的感染性疾病。目前為止，尚無理想的治療方法。基因疫苗（核酸DNA疫苗）的出現(xiàn)與發(fā)展，為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）的防治開創(chuàng)了新思路。如乙型肝炎基因疫苗作為特異性細胞免疫調(diào)節(jié)的治療手段，首次接種到10例CHB患者，發(fā)現(xiàn)能夠有效誘導CHB患者自身體內(nèi)HBV特異性細胞免疫應答[11]。韓國學者應用多表位編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗聯(lián)合拉米夫定治療12例CHB患者，療程和隨訪各52周，試驗顯示在獲得細胞免疫應答的6例患者中，未發(fā)生病毒學突破和反彈以及生化學突破[12]。以上臨床試驗研究為乙型肝炎DNA疫苗有效提高患者特異性細胞免疫功能進而清除病毒提供了有力的證據(jù)。

圖5 ELISPOT檢測的斑點圖（×200）A.PHA；B.Saline；C.Vector；D.pMCS2.S；E.pMCS2.S+pMCIIF（5 μg/只+5μg/只）；F.pMCS2.S+pMCIIF（10μg/只+10μg/只）。其中A、E和F均呈明顯的陽性，D呈弱陽性，而B和C幾乎無斑點，呈陰性Figure 5 Illustration of the ELISPOT assay （×200）

基因疫苗治療中，選用高效、安全的載體將目的基因轉(zhuǎn)移至真核細胞內(nèi)表達是最為關(guān)鍵的一步。目前用于基因治療的載體大多為非病毒載體（裸DNA質(zhì)粒載體），但這種質(zhì)粒載體的細胞轉(zhuǎn)染率低，結(jié)構(gòu)中含有細菌復制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隱藏的表達信號，在基因治療中可能引起嚴重的生物安全性問題[6]。微環(huán)質(zhì)粒載體的出現(xiàn)，較好地解決了這個問題。微環(huán)DNA是去除細菌序列和僅編碼治療基因的小超螺旋質(zhì)粒，較常規(guī)質(zhì)粒載體如pcDNA3系列、pVAX1、pCI等缺少細菌骨架序列，從而降低DNA疫苗的不良反應，并且在基因表達的持久性和細胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價閉環(huán)DNA相同，在DNA疫苗的構(gòu)建上具有很大優(yōu)勢[7]。Darquet等[13]和 Chen 等[7]在細胞培養(yǎng)實驗中證明了微環(huán)DNA比親本質(zhì)?；蚱渌麛y帶相同基因的傳統(tǒng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達水平都高3～10倍，大量體內(nèi)、外試驗證明，微環(huán)DNA具有表達時間長、表達效率高等特點。微環(huán)DNA的出現(xiàn)，為臨床研究提供了一個安全、高效的基因治療載體。

本實驗室前期構(gòu)建了一種抗HBV治療性雙質(zhì)粒DNA疫苗[10]，已經(jīng)進入臨床試驗中，其結(jié)果令人鼓舞[4，14]。因此，本文在前期的基因治療研究基礎(chǔ)上，采用微環(huán)載體構(gòu)建雙質(zhì)粒DNA疫苗pMCS2.S和pMCIIF，經(jīng)酶切和測序鑒定，微環(huán)雙質(zhì)粒疫苗的構(gòu)建完全正確，并轉(zhuǎn)染細胞實驗檢測目的基因的表達水平，結(jié)果表明目的基因的表達時間與原有載體preS2.S/pcDNA3.1和 hIL－2－IFN γ/pcDNA3.1的一致[15]，但表達水平大大提高。微環(huán)質(zhì)粒聯(lián)合EP技術(shù)進行BALB/c小鼠免疫注射，結(jié)果顯示，微環(huán)DNA粒pMCS2.S在健康小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生一定的體液和細胞免疫應答，佐劑微環(huán)質(zhì)粒pMCIIF可顯著增強pMCS2.S的免疫效果；低劑量即可誘導較強的免疫應答，而大劑量的免疫效果相當，但與空載體組或鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。

本實驗結(jié)果提示，微環(huán)載體構(gòu)建的雙質(zhì)粒DNA疫苗在小鼠體內(nèi)可誘導較強的免疫應答，為后續(xù)進一步藥物開發(fā)提供有力的實驗依據(jù)，也為該微環(huán)DNA質(zhì)粒的規(guī)?；a(chǎn)制備提供可能，后續(xù)實驗正在進行中，結(jié)果待發(fā)表。

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