秦雅群，李曉東，廖 昊，李 梵，盧珊珊，劉 妍，徐東平，李 進

我國現(xiàn)有HBV感染者約9300萬人，其中約2000萬人為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者[1]。HBV感染后臨床可表現(xiàn)為急性自限性肝炎、無癥狀 HBV 攜帶、CHB、肝硬化（liver cirrhosis,LC）、慢加急性肝衰竭（acute－on－chronic liver failure,ACLF）和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[2]。但是，HBV感染疾病進展的相關(guān)機制尚未完全闡明，除受感染年齡影響外，與機體免疫系統(tǒng)和病毒的相互作用密切相關(guān)[3]。

HBV為部分環(huán)狀雙鏈DNA，其基因組包含了S、P、C和X 4個開放讀碼區(qū)。S讀碼區(qū)分為前S（pre-S）1基因、pre-S2基因和S基因，各有其起始密碼子，但共用同一終止密碼子。核苷酸（nt）序列分別為 nt 2848-3204、nt 3205-154和 nt 155-835，分別編碼119個pre-S1蛋白、55個pre-S2蛋白及226個S蛋白。pre-S1和pre-S2蛋白包含多個T細胞和B細胞表位，與機體的免疫反應有密切的相互作用[4]。近年來不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)，pre-S基因的缺失突變可能導致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗體的結(jié)合能力發(fā)生改變。首先，pre-S基因的缺失可能使大蛋白在細胞表達過量，并在細胞中堆積，導致細胞形態(tài)的改變，從而加重疾病的進展，多項臨床研究均發(fā)現(xiàn)pre-S缺失突變與LC和HCC密切相關(guān)[5-7]。其次，HBV感染的決定區(qū)域位于pre-S1蛋白N端，通過與肝細胞表面?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽結(jié)合以感染肝細胞[8]；pre-S2蛋白包含多聚人血清ALB結(jié)合位點，在病毒裝配的過程中起關(guān)鍵作用[9]。此外，HBV pre-S基因有SP1和SP2兩個啟動子，其中SP2（nt2809-3152）大部分位于pre-S1基因內(nèi)，pre-S1缺失突變可影響SP2活性，進而影響中蛋白和小蛋白合成[10]。目前尚缺少針對慢性HBV感染者疾病進展的不同階段進行pre-S基因測序的研究，本研究對較大樣本量的CHB、LC、ACLF和HCC患者進行pre-S基因測序，并比較不同病程階段患者的pre-S缺失發(fā)生率以及發(fā)生缺失的熱點區(qū)域差異，以闡明HBV pre-S1和pre-S2基因缺失突變的臨床流行特點及其各自與疾病進展的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 樣本來源于2009年7月—2013年6月在解放軍第三〇二醫(yī)院就診的539例乙型肝炎患者，包括CHB患者146例（CHB組），LC患者111例（LC組），ACLF患者 146例（ACLF組），HCC患者136例（HCC組）。診斷按照相應指南進行[11-12]，排除HIV、HDV等混合感染者、酒精性肝病患者及自身免疫性肝病患者。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA的提取 采用綿陽高新區(qū)天澤基因工程有限公司生產(chǎn)的DNAout試劑。

1.2.2 HBV pre-S基因的擴增及測序 2輪巢式PCR擴增pre-S基因（nt2848-154）。第1輪擴增的上 游 引 物 為 PSFU1：5'-CCCTCGCCTCGCAGACGAAG-3'；下游引物為 PSFD1：5'-TTGGAGGACAA－

GAGGTTGGTGA-3'。第2輪擴增的上游引物為PSU12：5'-AGCGCCTCATTTTGTGGGTC-3'；下游引物 為 PSD42：5'-TGTAACACGAGCAGGGGTCC-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（0.7%瓊脂糖、1×Super Buffer，210 V，5min）鑒定后，送北京天一輝遠生物科技有限公司進行DNA序列測定，每個樣品均進行正、反雙向測序。用Vector NTI8.0軟件對序列測定峰圖結(jié)果進行比對，并對每個位點的序列峰圖依次進行分析，對正、反雙向測序結(jié)果進行比較印證。

1.2.3 pre-S基因缺失突變和缺失熱點區(qū)域分析 將測序獲得的序列與NCBI genotyping tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi）收錄HBV/C基因型全基因組標準序列的pre-S和S基因相比較（序列號AB014381），鑒定pre-S基因缺失突變。與標準序列相比，pre-S基因發(fā)生3個堿基及以上的缺失鑒定為缺失突變。1.2.4 相關(guān)指標的檢測 HBV DNA應用實時熒光PCR進行定量測定，檢測儀器為羅氏Light Cycler 480Ⅱ檢測儀。血清HBsAg水平用電化學發(fā)光法進行檢測。ALT和TBIL水平采用Olympus AU 5000自動分析儀進行測定。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。定量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用x±s表示，缺失片段長度用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。定量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗；多組定性數(shù)據(jù)比較采用R×Cχ2檢驗，兩兩比較用Scheffe法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組基本臨床資料 4組患者性別組成差異無統(tǒng)計學意義。年齡方面，HCC組高于CHB組（P＜0.05）。血清HBV DNA水平方面，HCC組高于LC組（P＜0.05）。各組ALT水平差異有統(tǒng)計學意義，ACLF組＞CHB組＞LC組＞HCC組。TBIL水平方面，ACLF組顯著高于其他3組，CHB組高于LC組和HCC組（P均＜0.05）。見表1。

2.2 4組pre-S基因缺失率比較 4組患者pre-S基因總體缺失率差異有統(tǒng)計學意義，HCC組和LC組顯著高于CHB組（P＜0.05）；4組pre-S1基因缺失率差異有統(tǒng)計學意義，LC組顯著高于CHB組（P＜0.05）；4組pre-S2基因缺失率差異有統(tǒng)計學意義，HCC組顯著高于CHB組（P＜0.05）。見表2。

2.3 4組S基因缺失熱點區(qū)域比較 通過分析不同病程階段患者pre-S基因序列，發(fā)現(xiàn)pre-S1基因翻譯起始位置（nt2849-2866）和pre-S2基因翻譯起始位置（nt 5-55）是最常發(fā)生缺失的位置；不同病程階段患者缺失發(fā)生熱點也不相同（表3）。以CHB組為例，146例CHB患者中有23例發(fā)生pre-S總體缺失，其中nt3031-3215和nt24-57為缺失最常發(fā)生的區(qū)域，各有7例（30.4%）。不同病程階段患者pre-S基因缺失片段長度差異無統(tǒng)計學意義。

表1 4組基本臨床資料比較Table 1 Com parison of clinical data among 4 groups of patients w ith different illness categories

表2 4組pre-S基因缺失率比較［例(%)］Table 2 Comparison of deletion rates of pre-S gene among 4 groups of patients w ith different illness categories[cases(%)]

表3 4組發(fā)生缺失突變的熱點區(qū)域及缺失片段長度Table 3 Hot spots and fragment lengths of deletion mutation in 4 groups of patients w ith different illness categories

3 討 論

慢性HBV感染者病情的臨床轉(zhuǎn)歸與病毒、宿主及環(huán)境因素密切相關(guān)[2]。在感染者體內(nèi)，HBV核酸成分容易發(fā)生變異，引起病毒生物學特點的變化，其結(jié)果可導致疾病的慢性化并不斷誘導肝細胞炎性損害，增加產(chǎn)生新的HBV基因變異的機會；同時變異病毒毒力增強和抗原表位發(fā)生改變，可能引起過度免疫應答反應，造成嚴重的肝細胞損傷，使得慢性HBV感染者疾病進展[3]。HBV pre-S區(qū)是變異最大的區(qū)域，易影響機體的免疫反應以及病毒復制力和致病性，從而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。既往研究表明，不同國家及人群的pre-S缺失檢出率存在明顯差異。Chen等[13]研究12個國家pre-S突變流行率，發(fā)現(xiàn)中國乙型肝炎患者pre-S缺失檢出率平均為22.4%，日本pre-S缺失檢出率為23%。韓國學者Mun等[14]檢測了120例乙型肝炎不同疾病程度的患者，發(fā)現(xiàn)總體pre-S缺失率為30.8%。在本研究中，我國乙型肝炎相關(guān)患者的總體缺失率為24.1%，與以往研究結(jié)果相似。

一般來講，乙型肝炎患者感染病毒的時間越長，體內(nèi)越容易積累病毒變異?？紤]到我國乙型肝炎患者很多是母嬰垂直傳播，患者的年齡一定程度上可以反應患者的感染時間。本研究中4組患者的年齡總體上有差異，但兩兩比較的結(jié)果顯示僅HCC組患者的年齡高于CHB組患者，LC組和ACLF組與CHB組相比并無差別；本研究的病例樣本較大，可在一定程度上平衡年齡差別帶來的病毒變異差異，后續(xù)工作中我們將進行進一步的配對分層比較。

目前公認pre-S基因缺失與LC和HCC都有密切關(guān)系，但pre-S1和pre-S2基因缺失各自的臨床意義卻存在爭議。pre-S1和pre-S2基因包含的功能區(qū)域不一樣，因此缺失引起疾病進展的模式也可能存在差異。pre-S1基因涵蓋位點多為與病毒生活周期相關(guān)的位點，包含與宿主受體結(jié)合的功能域；而pre-S2基因涵蓋大量的T細胞和B細胞表位，對免疫壓力的反應更活躍[7]。一般認為pre-S2缺失突變是HCC的高風險因素，有研究顯示pre-S2缺失突變可能使得大蛋白、中蛋白和小蛋白比例失調(diào)，大蛋白在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上過量產(chǎn)生和滯留，增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，導致宿主基因不穩(wěn)定，增加DNA損傷和基因突變頻率，造成肝細胞進一步損傷及 HCC 的發(fā)生[7，15-16]。但也有 Mun等[14]研究發(fā)現(xiàn)pre-S1缺失突變更常出現(xiàn)在HCC患者中，而pre-S2缺失突變則更常在LC患者中檢測到，破壞pre-S1起始密碼的缺失突變在HCC進展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，LC患者pre-S1基因缺失率顯著高于CHB患者，而HCC患者pre-S2缺失率則顯著高于CHB患者，與多數(shù)研究的共識一致。該結(jié)果提示pre-S1和pre-S2基因缺失突變的致病機制存在差異，pre-S1基因缺失突變與LC更為相關(guān)，而pre-S2基因缺失突變則可能參與了HCC癌變進程。

既往研究中pre-S基因任意片段和任意位置的缺失都統(tǒng)稱為pre-S基因缺失突變，較少將pre-S缺失的位置和缺失片段長度與疾病進展關(guān)聯(lián)起來。本研究較為系統(tǒng)地比較了不同病程階段患者的缺失發(fā)生熱點區(qū)域和缺失片段長度的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4組患者發(fā)生缺失的熱點區(qū)域各不相同：CHB患者的缺失突變多發(fā)生在pre-S1蛋白C末端，LC和ACLF患者多發(fā)生在pre-S1蛋白的翻譯起始端（N端），HCC患者則多發(fā)生在pre-S2蛋白的翻譯起始位置。這種缺失位點的差異可能與pre-S1和pre-S2蛋白所承擔的不同功能相關(guān)。此外，4組患者的缺失片段長度的差異無統(tǒng)計學意義，該結(jié)果提示缺失長度可能與疾病進展并無直接關(guān)系。

綜上所述，本研究根據(jù)患者不同病程階段，分組分析了較大樣本量慢性HBV感染者pre-S基因缺失突變的臨床檢出率及其臨床意義，發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者中，隨著疾病進展pre-S基因缺失率呈上升趨勢，其中pre-S1基因缺失突變與LC更為相關(guān)，而pre-S2基因缺失突變則可能參與了肝臟癌變進程。pre-S基因缺失突變熱點區(qū)域為pre-S1和pre-S2基因的翻譯起始位置。此外，pre-S基因缺失的片段長度可能并不影響疾病進展，但pre-S基因缺失的位置則可能對疾病進展產(chǎn)生影響。pre-S1和pre-S2缺失突變在LC和HCC發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制還有待進一步研究闡明。

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