龔文平，溫博海

斑點(diǎn)熱是由立克次體屬（Rickettsia）的斑點(diǎn)熱群立克次體（spotted fever group Rickettsiae,SFGR）引起的一類(lèi)以急性發(fā)熱和全身皮疹為主要特征的疾病總稱(chēng)。SFGR是一類(lèi)全球性分布、嚴(yán)格血管內(nèi)皮細(xì)胞寄生的革蘭陰性小桿菌，是立克次體目中最大和最復(fù)雜的一群，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19種能引起人感染的SFGR（表1）。其中立氏立克次體（Rickettsia rickettsii）在立克次體中毒性最強(qiáng)，其所致的落基山斑點(diǎn)熱（Rocky Mountain spotted fever,RMSF）在無(wú)抗生素時(shí)代病死率高達(dá)60%～80%，即便在抗生素治療（立克次體對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素敏感）的情況下病死率仍為5%～10%[1-2]。因此，立氏立克次體被聯(lián)合國(guó)列入生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑清單[3]。

斑點(diǎn)熱主要通過(guò)蜱叮咬傳播，潛伏期2～14 d。不同SFGR引起的感染有不同的病名，但臨床癥狀大致相同，主要表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、疲倦和肌肉酸痛，伴隨著由四肢向軀干方向發(fā)展的皮疹[4]。立克次體感染引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引發(fā)局部和全身血管損傷，隨著病情發(fā)展，患者可因低血壓休克、急性腎衰竭、肺水腫和腦膜炎等嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡[5]。

斑點(diǎn)熱早期缺乏特異性臨床癥狀，難以確診，患者往往因被誤診不能得到及時(shí)治療而死亡。預(yù)防斑點(diǎn)熱，尤其是立氏立克次體自然感染或人為攻擊，迫切需要安全、有效、不良反應(yīng)少的疫苗[3]。本文就疫苗的研究進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行綜述。

1 滅活疫苗

和大多數(shù)疫苗的發(fā)展歷程相同，斑點(diǎn)熱疫苗研究的起點(diǎn)是滅活疫苗，根據(jù)技術(shù)和方法的不同又分為3個(gè)階段。1925年，Spencer和Parker首先進(jìn)行滅活立氏立克次體的RMSF疫苗研究[3]。他們首先將處于饑餓狀態(tài)的蜱放在立氏立克次體感染的豚鼠身上吸血，使立克次體在蜱體內(nèi)大量繁殖，隨后將繁殖的立克次體從蜱體粗分離，再用酚和甲醛滅活立克次體制備滅活疫苗。遺憾的是，追蹤研究15年后發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗免疫僅能減輕立氏立克次體感染的臨床癥狀，對(duì)降低病死率并不顯著[6]。1938年，Herald首次將立氏立克次體在雞胚卵黃囊中大量繁殖成功，從雞胚卵黃囊膜中提取立氏立克次體，然后用苯酚和福爾馬林將提取的立克次體滅活后制備疫苗[3]。但是，后來(lái)的研究證明用雞胚繁殖立氏立克次體滅活疫苗免疫保護(hù)效果也不理想[3]。

表1 SFGR概況一覽表[4]Table 1 Known human spotted fever group rickettsial pathogens[4]

接踵而來(lái)的失敗使斑點(diǎn)熱疫苗的研究履步維艱，直到1975年來(lái)自美國(guó)陸軍傳染病研究所的Kenyon和Pedersen[7]報(bào)道成功地利用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)出純度很高的立氏立克次體，這一成果為RMSF疫苗的研發(fā)注射了一劑強(qiáng)心針。1983年采用滅活雞胚細(xì)胞培養(yǎng)立氏立克次體對(duì)疫區(qū)志愿者進(jìn)行免疫接種[3]，結(jié)果顯示該滅活疫苗可保護(hù)四分之一的志愿者，能明顯減輕發(fā)熱等臨床癥狀，增強(qiáng)四環(huán)素的治療效果。盡管該細(xì)胞培養(yǎng)立氏立克次體滅活疫苗的保護(hù)效果仍不夠理想，但是這一研究成果為大量培養(yǎng)立克次體奠定了基礎(chǔ)，給RMSF疫苗的研發(fā)帶來(lái)新的希望。

2 減毒活疫苗

與滅活疫苗比較，減毒活疫苗具有用量少、免疫持久、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，但是由于減毒活疫苗有可能在體內(nèi)突變而出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的危險(xiǎn)，烈性傳染病減毒活疫苗的研究應(yīng)非常謹(jǐn)慎。SFGR的致病能力千差萬(wàn)別，即便是同一種立克次體，不同菌株的致病能力也可明顯不同，同一株立克次體對(duì)人和動(dòng)物的病理?yè)p傷也不盡相同[8]。雖然減毒貝氏柯克斯體做Q熱疫苗[9]以及普氏立克次體弱毒株（E株）做流行性斑疹傷寒疫苗[10]已有報(bào)道，但斑點(diǎn)熱減毒活疫苗的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

3 亞單位疫苗

隨著20世紀(jì)70年代后蛋白質(zhì)和基因分析等生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以及免疫保護(hù)效能評(píng)價(jià)方法的改善，使得許多立克次體保護(hù)性抗原得到識(shí)別。斑點(diǎn)熱疫苗的研究熱點(diǎn)從滅活疫苗轉(zhuǎn)向亞單位疫苗。特別是最近德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部學(xué)者采用反向疫苗學(xué)體外篩選和體內(nèi)篩選相結(jié)合法鑒定出能被CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別的4個(gè)普氏立克次體保護(hù)性抗原[11]，它們除能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗普氏立克次體引起的流行性斑疹傷寒外，還能誘導(dǎo)交叉保護(hù)對(duì)抗莫氏立克次體引起的地方性斑疹傷寒，為篩選抗立克次體保護(hù)性抗原及研發(fā)亞單位疫苗提供新的有效途徑。

3.1 外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白B（OmpB）

1944年Topping和Shear[12]從乙醚處理后的立氏立克次體中發(fā)現(xiàn)了群特異的“可溶性”補(bǔ)體結(jié)合抗原。2年后，Shepard和Wyckoff[13]通過(guò)電鏡技術(shù)證明“可溶性”抗原來(lái)自立克次體細(xì)胞膜。1974年，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）技術(shù)對(duì)乙醚處理后的立氏立克次體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)“可溶性”抗原包含9個(gè)分子量為28～150 kDa的蛋白，立氏立克次體至少含有30多種分子量為23～155 kDa的蛋白，其中分子量為 120 kDa（OmpB）和 155 kDa（OmpA）的 2 個(gè)蛋白為高豐度膜蛋白[14]，以后的研究證明其在立克次體粘附和入侵宿主細(xì)胞等致病性方面發(fā)揮著重要的作用[15]。此外，OmpA已被證實(shí)可用作SFGR基因型和亞型之間的鑒別[16]。

1985年有研究用立氏立克次體單克隆抗體被動(dòng)免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)僅僅針對(duì)170 kDa（OmpA）和133 kDa（OmpB）2個(gè)大分子的單克隆抗體具有特異性免疫保護(hù)效能[17]。之后用立氏立克次體重組OmpB免疫豚鼠，攻毒后顯示免疫豚鼠能有效抵抗立氏立克次體的攻擊[18]。Feng等[19]用立氏立克次體重組OmpA和OmpB分別免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)這2種免疫血清均能中和立氏立克次體毒性，用立氏立克次體或康氏立克次體OmpA或OmpB單克隆抗體被動(dòng)免疫小鼠能夠提供小鼠對(duì)抗同源立克次體攻擊的有效保護(hù)。在立克次體感染過(guò)程中，F(xiàn)c受體介導(dǎo)的免疫效應(yīng)功能[19]和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[20]與巨噬細(xì)胞的吞噬調(diào)理有關(guān)[21]。研究證明Fc依賴的特異性抗體可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)理素[22]、一氧化氮和過(guò)氧化氫來(lái)抑制立克次體感染內(nèi)皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞[23]。

許多研究發(fā)現(xiàn)OmpA和OmpB特異性抗體在抑制SFGR粘附和入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用，但是大量研究也證實(shí)清除寄生于胞內(nèi)的立克次體主要依賴特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。用立氏立克次體OmpA的DNA片段做疫苗，結(jié)果免疫小鼠能抵抗親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的康氏立克次體的攻擊；同時(shí)發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗能刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高水平的干擾素（interferon,IFN）γ，提示OmpA特異的細(xì)胞免疫提供了交叉保護(hù)[24]。此外，用康氏立克次體感染小鼠，發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在清除小鼠體內(nèi)立克次體時(shí)甚至比CD4+T淋巴細(xì)胞更重要[25]。隨后發(fā)現(xiàn)高水平的OmpA和OmpB特異性抗體出現(xiàn)在立克次體感染恢復(fù)期[19]，提示出現(xiàn)較晚的特異性抗體主要在對(duì)抗立克次體再次感染時(shí)起重要作用，而對(duì)抗原發(fā)性立克次體感染主要依賴特異性細(xì)胞免疫。

3.2 Adr1、Adr2和YbgF 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展，21世紀(jì)伊始已有幾種新的細(xì)胞表面蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2006年，法國(guó)學(xué)者率先通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了立克次體粘附素Adr1和Adr2，證明二者在立克次體粘附與入侵中扮演著重要的角色，拓展了斑點(diǎn)熱亞單位疫苗的研究領(lǐng)域[26]。2011年，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)普氏立克次體外膜蛋白Adr2在立克次體粘附和入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用[27]。

近年來(lái)，我國(guó)溫博海團(tuán)隊(duì)通過(guò)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)技術(shù)成功鑒定出黑龍江立克次體表面蛋白YbgF以及立氏立克次體表面蛋白Adr1、Adr2和YbgF，并用透射免疫電鏡技術(shù)首次對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位[15，28]。將這些表面蛋白分別免疫小鼠，用定量PCR分析其肝、脾、肺等立克次體感染靶器官的立克次體載量，結(jié)果顯示rYbgF和rAdr2蛋白可提供小鼠特異性免疫保護(hù)，有效抵抗致死量黑龍江立克次體或立氏立克次體的感染。最近，該團(tuán)隊(duì)證明重組立氏立克次體蛋白抗原rAdr2和rOmpB的聯(lián)合免疫保護(hù)效能顯著好于rAdr2和rOmpB單抗原免疫[29]。隨后他們研究了這些立氏立克次體保護(hù)性抗原的免疫保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抗原特異的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞經(jīng)立氏立克次體保護(hù)性抗原刺激后能產(chǎn)生高水平的IFNγ和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α，提示這些保護(hù)性抗原均能刺激抗原特異性CD4+Th1淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞迅速產(chǎn)生和分泌大量IFNγ和TNF-α，提示特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在該抗原誘導(dǎo)的特異性免疫保護(hù)中起關(guān)鍵作用[29-31]。

4 DNA疫苗

隨著如火如荼的亞單位疫苗研發(fā)，立克次體DNA疫苗的研究開(kāi)始初現(xiàn)端倪。2001年研究報(bào)道選取立氏立克次體OmpA的1個(gè)片段構(gòu)建重組結(jié)核分枝桿菌疫苗和重組DNA疫苗，用其免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者抗康氏立克次體感染保護(hù)率分別為67%和55%，當(dāng)DNA疫苗免疫后再用蛋白疫苗加強(qiáng)免疫時(shí)保護(hù)率上升至75%[24]。2003年美國(guó)馬里蘭州大學(xué)用普氏立克次體入侵相關(guān)基因invA、細(xì)胞分裂相關(guān)基因fts、蛋白分泌相關(guān)基因sec、毒力相關(guān)基因 ompA、ompB、virB、cap、tlyA 及 tlyC 成功構(gòu)建重組DNA質(zhì)粒[32]，但是這些DNA質(zhì)粒的免疫保護(hù)效能未見(jiàn)評(píng)價(jià)。2007年美國(guó)學(xué)者完成了立氏立克次體強(qiáng)毒株“Sheila Smith”全基因組的測(cè)序，次年完成了弱毒株“Iowa”全基因組測(cè)序[33]，比較二者的全基因組序列將為研發(fā)RMSFDNA疫苗和其他分子疫苗奠定重要基礎(chǔ)。

5 表位肽疫苗

盡管OmpA、OmpB、Adr2和YbgF等細(xì)胞表面蛋白先后被發(fā)現(xiàn)并證明是免疫保護(hù)性抗原，但其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不能持久，如要獲得較為持久的特異性免疫應(yīng)答勢(shì)必要加大免疫劑量和次數(shù)，隨之增加的不良反應(yīng)和有限的保護(hù)效能成為亞單位疫苗發(fā)展的瓶頸。

隨著免疫學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞通常僅識(shí)別抗原分子上的一個(gè)特定氨基酸序列即表位（epitope），又稱(chēng)為抗原決定簇。表位又可分為T(mén)淋巴細(xì)胞表位和B淋巴細(xì)胞表位，分別誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答?？乖砦坏蔫b定對(duì)研發(fā)表位肽疫苗具有重要意義[34]。

雖然針對(duì)立克次體的表位肽疫苗近幾年才走進(jìn)人們的視野，但是相關(guān)研究卻要追溯到1991年，美國(guó)沃爾特里德陸軍研究所團(tuán)隊(duì)利用SDS-PAGE分析恙蟲(chóng)病立克次體表面抗原時(shí)，找到了一系列大小為18～35 kDa的蛋白，其中1個(gè)22 kDa的蛋白引起了他們的注意[35]。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了潛在的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表位。此后數(shù)十年，由于亞單位疫苗的興起使得處于萌芽狀態(tài)的表位肽疫苗研究被束之高閣。直到2003年重啟表位肽疫苗的研究，從康氏立克次體OmpB蛋白中篩選出5條能夠刺激CD8+T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ的表位肽，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中3條不僅能刺激CD8+T淋巴細(xì)胞增殖并分泌IFNγ，而且還可促進(jìn)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷作用[36]。2006年，英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)在研究立克次體進(jìn)化時(shí)指出，OmpA和OmpB蛋白在歷經(jīng)自然選擇后，立克次體的許多至關(guān)重要的氨基酸序列比較集中地出現(xiàn)在某幾個(gè)區(qū)域，而這些區(qū)域很可能就是表位肽的隱身之處[37]。

6 展 望

從滅活疫苗到表位肽疫苗，斑點(diǎn)熱疫苗的研究已走過(guò)了100多年的歷程。滅活疫苗作為斑點(diǎn)熱疫苗研究的鼻祖有著重要的意義，但由于其制備難度高、不良反應(yīng)大、保護(hù)率低等不得不存封在歷史的記憶中。亞單位疫苗雖然彌補(bǔ)了滅活疫苗的很多不足，但是其免疫保護(hù)效果仍與人們的目標(biāo)相差甚遠(yuǎn)。最新研究證明多保護(hù)性抗原組合或T和B淋巴細(xì)胞表位肽組合能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更全面的免疫應(yīng)答和更強(qiáng)的特異性抵抗，同時(shí)具有安全、可靠、生產(chǎn)方便的特點(diǎn)，為斑點(diǎn)熱分子疫苗的研發(fā)展現(xiàn)了美好前景。

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