趙然 王學(xué)哲 李紅 王鵬

強(qiáng)力霉素增強(qiáng)胃癌細(xì)胞化療敏感性的研究

趙然 王學(xué)哲 李紅 王鵬

目的探討強(qiáng)力霉素(doxycycline, DOXY)對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823化療藥物敏感性的影響及其作用機(jī)制。方法四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用, 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量；Western blot法分別檢測(cè)蛋白激酶(AKT1)/NF-kappaB/Notch1水平的表達(dá)變化。結(jié)果與DOXY和阿霉素(ADR)單獨(dú)用藥組比較, 兩藥聯(lián)合用藥可提高ADR對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞的增殖抑制率﹑誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡﹑增加活性氧的含量, 上調(diào)AKT1/NF-kappaB/Notch1的表達(dá)。結(jié)論DOXY 能夠增強(qiáng)胃癌BGC823細(xì)胞化療敏感性, 其機(jī)制可能與增加活性氧的含量, 上調(diào)AKT1/NF-kappaB/Notch1的表達(dá)有關(guān)。

強(qiáng)力霉素；胃癌；化療增敏；蛋白激酶

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性的高低是評(píng)價(jià)化療在腫瘤治療中是否成功的關(guān)鍵因素。增加化療敏感性的方法多為加大藥物劑量和聯(lián)合用藥。但是隨著有效的抗增殖劑如ADR用藥劑量的增大, 在提高療效的同時(shí)對(duì)正常組織的毒性也會(huì)相應(yīng)增加, 且長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性［1-3］。因此, 尋求高效低毒的聯(lián)合用藥治療方案是腫瘤化療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

1 材料與方法

1.1 材料 DOXY購于Sigma公司, ADR購于山東普德藥業(yè)有限公司, 胰蛋白酶﹑RPMI-1640 培養(yǎng)基﹑胎牛血清(FBS)﹑青鏈霉素購于Gibco公司；PTEN, Notch1, AKT1, β-actin抗體購于Santa cruz 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DCFDA 購于Sigma公司, 胃癌BGC823細(xì)胞, 北京大學(xué)人民醫(yī)院郁衛(wèi)東老師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理復(fù)蘇的胃癌細(xì)胞BGC823胃癌細(xì)胞系BGC823加入含有10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中, 37℃,飽和濕度, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 隔日換液。實(shí)驗(yàn)組分別加用不同濃度的藥物, 每孔終體積為150 μl, 對(duì)照組加入等體積RPMI 1640 培養(yǎng)基, 設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分以下 4 組：①空白組；②DOXY組(20 μg/ml)；③ADR組(10 μg/ml)；④DOXY+ADR組(5/10 μg/ml)。各組細(xì)胞于培養(yǎng) 36 h 時(shí)進(jìn)行收集, 用PBS洗滌 2 次, 預(yù)冷的70%乙醇固定過夜, 再經(jīng)PBS 洗滌 2 次, 離心, 加入含有 100 μg/ml RNA 酶和 50 μg/ml PI的混合液 1 ml, 重新懸浮細(xì)胞, 室溫避光孵育 20 min, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率 各組分別于培養(yǎng)24﹑48﹑72 h, 采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。DOXY 增敏倍數(shù) = IC50(DDP)/ IC50(DDP + DOXY)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用 χ2檢驗(yàn)。多組間比較用單向方差分析(One-wayANOVA)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果顯示, 呈劑量-時(shí)間依賴性。空白組24﹑48﹑72 h劑量為0；ADR組分別為(0.71±0.04)ug/ml﹑(0.95±0.15)ug/ml﹑(1.46±0.32)ug/ml；DOXY組分別為(0.97±0.06)ug/ml﹑(1.76± 0.35)ug/ml﹑(1.92±0.43)ug/ml；DOXY+ADR組分別為(1.11± 0.10)ug/ml﹑(2.03±0.45)ug/ml﹑(2.48±0.54)ug/ml。各濃度組細(xì)胞增殖抑制率與相同濃度作用下, 不同作用時(shí)間的細(xì)胞增殖抑制率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DOXY﹑ADR和DOXY+ ADR組分別為：(16.8±1.2)﹑(19.0±1.3)﹑(24.1±1.6), 而空白組則為(4.9±1.3), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 實(shí)驗(yàn)顯示, ADR組作用于BGC823細(xì)胞后, 增加的活性氧濃度(132.8±12.9)大于單獨(dú)使用DOXY組(118.3±9.4), DOXY+ADR組活性氧濃度(157.5±10.4)含量明顯增加, 與空白組(87.9±11.2)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 ADR作用于胃癌 BGC823 細(xì)胞后, 增加了AKT1蛋白的表達(dá), 通過表達(dá)上調(diào)NF-kappaB, 進(jìn)而激活下游基因Notch1蛋白的表達(dá), 從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。見表1。

表1 四組的蛋白表達(dá)情況對(duì)比(±s)

表1 四組的蛋白表達(dá)情況對(duì)比(±s)

組別 AKT1 NF-kappaB Notch1空白組 0.69±0.05 0.52±0.04 0.33±0.02 DOXY組 1.78±0.17 0.82±0.11 0.56±0.03 ADR組 2.01±0.23 1.28±0.15 0.61±0.03 DOXY+ADR組 2.34±0.25 1.68±0.21 0.78±0.02

3 小結(jié)

DOXY的優(yōu)點(diǎn)是持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的以及毒性較小, 因此可以被認(rèn)為是與其他藥劑聯(lián)合使用的癌癥化療候選藥物, 通過與其他藥物聯(lián)合使用, 可降低化療的劑量, 減少其不良反應(yīng)的發(fā)生, 另外藥物間還可能產(chǎn)生作用, 從而增強(qiáng)療效。

綜上所述, DOXY結(jié)合化療藥物治療胃癌有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用潛力, 并改善癌癥化療。

［1］周鑫. ERCC1﹑TP/DPD對(duì)胃癌化療敏感性的體外研究.山東大學(xué), 2013.

［2］劉如璐. 自噬調(diào)控對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞化療敏感性的影響及機(jī)制研究. 蘇州大學(xué), 2013.

［3］杜鵬. Bcl-2/mTOR通路阻斷對(duì)增加HepG2細(xì)胞化療敏感性的研究. 蘇州大學(xué), 2011.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.23.220

2015-08-04］

121001 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科(趙然王學(xué)哲 王鵬)；遼寧醫(yī)學(xué)院遼寧省錦州市 (李紅)

王學(xué)哲