李敏　宋陸軍　高曉東　常文舉　付亮　秦新裕

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上?！?00032)

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·論著·

非肥胖性糖尿病小鼠在1型糖尿病發(fā)病過程中的基因表達(dá)譜改變

李敏宋陸軍高曉東常文舉付亮秦新裕

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海200032)

摘要目的：用基因表達(dá)譜芯片檢測非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠在1型糖尿病(T1DM)發(fā)病過程中的基因表達(dá)。方法： 分離T1DM未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠的胰島細(xì)胞，提取其總RNA后，與瑞士Roche NimbleGen公司的 12×135K基因表達(dá)譜芯片雜交。采用NimbleScan軟件分析表達(dá)數(shù)據(jù)。結(jié)果：未發(fā)病NOD小鼠組和發(fā)病NOD小鼠組共有1007個(gè)差異表達(dá)基因?；虮倔w(gene ontology，GO)分析顯示，在生物學(xué)過程方面，上調(diào)基因中87.7%與代謝相關(guān)，下調(diào)基因中18.97%與代謝相關(guān)；在細(xì)胞組分方面，29.20%的上調(diào)基因與細(xì)胞及細(xì)胞成分相關(guān)，78.08%的下調(diào)基因與細(xì)胞骨架、微管細(xì)胞骨架相關(guān)；在分子功能方面，84.07%的上調(diào)基因與結(jié)合有關(guān)，30.77%下調(diào)基因與水解酶活性相關(guān)。Pathway分析顯示，上調(diào)的信號(hào)通路主要為黏蛋白型O聚糖合成信號(hào)通路，下調(diào)的信號(hào)通路主要為血管加壓素信號(hào)通路。結(jié)論：T1DM發(fā)病NOD小鼠和未發(fā)病NOD小鼠的胰島細(xì)胞的基因表達(dá)水平有明顯差異。

關(guān)鍵詞小鼠；1型糖尿??；基因表達(dá)譜芯片

基本項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：20090071110019)；上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：09ZR1405900)；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年科學(xué)基金(編號(hào)：2013ZSQN23)

截至2013年，全球糖尿病患者已達(dá) 3.82億例，預(yù)計(jì)到2035年將達(dá)5.92億例[1]。糖尿病有兩種類型，其中1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是由于機(jī)體自身抗原耐受機(jī)制破壞而導(dǎo)致的一種器官特異性的免疫性疾病，它是由自身反應(yīng)性CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤胰島而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷而引起的。目前認(rèn)為，免疫、基因和環(huán)境等因素共同參與了T1DM的發(fā)生與發(fā)展[2]。

非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠可以自發(fā)T1DM，且同人類T1DM的發(fā)病特點(diǎn)相似，故NOD小鼠是國際公認(rèn)的T1DM模型。本研究通過基因表達(dá)譜芯片檢測T1DM發(fā)病與T1DM未發(fā)病NOD小鼠胰島細(xì)胞的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在T1DM的發(fā)病過程中有多條信號(hào)通路被激活，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑4～30周雌性NOD小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量25～34 g，無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級(jí)。膠原酶V、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、煙酰胺、雙硫腙(dithizone，DTZ)購自美國Sigma-Aldrich 公司； RPMI 1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；Ficoll 400購自美國Pharmacia 公司；Hanks、D-Hanks液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；毛細(xì)吸管購自美國BD 公司；基因表達(dá)譜芯片購自瑞士Roche NimbleGen公司。

1.2小鼠胰島的分離和純化麻醉小鼠后，開腹，在膽總管靠近十二指腸的一側(cè)剪開一個(gè)小口。將輸液器頭插入1 mL胰島素注射器內(nèi)，抽取2.5 mL膠原酶(1 mg/mL)；在針頭部插入超細(xì)軟管，將導(dǎo)管插入膽總管內(nèi)，遠(yuǎn)端靠近肝門部結(jié)扎。注入2 mL 膠原酶，可見胰腺組織迅速膨脹，呈透明狀。切取胰腺組織后放入D-Hanks 液，37℃水浴靜止消化15 min。消化后輕微震蕩，至胰腺組織呈細(xì)沙狀，加入4℃的含有10%胎牛血清的D-Hanks 40 mL終止消化，以1000 r/min離心2 min后棄上清液；重復(fù)3 遍。配置分離液，步驟如下：首先配置50%的Ficoll液，稱取10 g Ficoll，溶解于20 mL D-Hanks液中，在37℃溶解4 h；配置25%的Ficoll液，取9.2 mL 25%的Ficoll液，加入0.8 mL D-Hanks 液，或?yàn)?3%的Ficoll液；取8 mL 25%的Ficoll液，加入 D-hanks 至10 mL，為20%的Ficoll液；取4.4 mL 25%的Ficoll液，加D-Hanks 至10 mL，為11%的Ficoll液。在含有胰島細(xì)胞的沉淀液中加入5 mL 25%的Ficoll液，混勻，然后依次加入4 mL 23%的Ficoll液、3 mL20%的Ficoll液、3 mL 11%的Ficoll液，1800 r/min離心5 min。在20%~23%界面和11%~20%界面收集胰島細(xì)胞。加入0℃的 D-Hanks 液洗滌后，1000 r/min離心3 min；重復(fù)2 次，收集胰島細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗滌后，用無菌的毛細(xì)移液管在相差顯微鏡下挑選單個(gè)胰島，將胰島用DTZ染色，以保證培養(yǎng)胰島的純度[3]。

1.3T1DM未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠胰腺組織基因組分析分別提取T1DM未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠胰島細(xì)胞的總RNA，用美國 Nanodrop 公司ND-1000分光光度計(jì)檢測及變性瓊脂糖凝膠電泳對樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測。每組取5 μg RNA用于標(biāo)記及芯片雜交。將掃描得到的圖像導(dǎo)入NimbleScan 軟件(VER 2.5)，進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)等相關(guān)分析。該部分實(shí)驗(yàn)由上?？党缮镉邢薰就瓿伞?/p>

2結(jié)果

2.1T1DM未發(fā)病NOD小鼠與發(fā)病NOD小鼠胰腺胰島細(xì)胞樣本總RNA電泳圖未發(fā)病NOD小鼠與發(fā)病NOD小鼠胰腺胰島樣本總RNA的電泳圖(圖1)。從電泳圖上可以看到3條清晰的 5S、18S、28S rRNA條帶，條帶依次加深，且28s rRNA的亮度約為18s rRNA的2倍。分光光度儀檢測顯示， OD260/OD280比值均為 1.9～2.0，提示總 RNA 質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　未發(fā)病NOD小鼠與發(fā)病NOD小鼠胰腺胰島樣本

2.2NOD小鼠胰島的基因芯片雜交結(jié)果用未發(fā)病NOD小鼠與發(fā)病NOD小鼠的胰島細(xì)胞樣本提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄ds-cDNA并用Cy3熒光素標(biāo)記后，分別與NimbleGen 12×135K基因表達(dá)譜芯片在42℃雜交16～20 h，用美國AXON公司GenePix4000B芯片掃描儀掃描得到芯片雜交圖象。采用專業(yè)軟件分析雜交圖像文件，提取基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，將掃描得到的圖像導(dǎo)入NimbleScan軟件(VER 2.5)，進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)等相關(guān)分析，剔除表達(dá)程度過低的基因，從而得到未發(fā)病NOD小鼠和發(fā)病NOD小鼠胰島的芯片雜交圖。表達(dá)譜芯片上可見密集的Cy3 綠色熒光。見圖2。

2.3分層聚類分析采用分層聚類分析對樣品的表達(dá)水平進(jìn)行重新分組，探索樣本之間的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示，兩組表達(dá)譜明顯不同。

A：未發(fā)病鼠；B：發(fā)病鼠

樹枝的長度表示兩組數(shù)據(jù)的相似程度，紅色顯示兩組基因表達(dá)緊密相關(guān)，藍(lán)色部分顯示兩組間關(guān)系不密切

圖3分層聚類分析樹狀圖

2.4GO分析為了詳細(xì)研究差異表達(dá)基因的功能分類，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析。GO分析從生物學(xué)過程、分子功能和亞細(xì)胞組分三個(gè)方面對基因的功能進(jìn)行分類，每大類又可分為下一級(jí)及更下一級(jí)的分支。根據(jù)挑選出的差異基因，計(jì)算這些差異基因同GO分類中某(幾)個(gè)特定分支的超幾何分布關(guān)系。GO分析會(huì)對每個(gè)有差異基因存在的GO得出一個(gè)P值，P值越小(P≤0.05)表示差異基因在該GO中的富集越明顯。

對GO分析結(jié)果作餅圖，結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因涉及生物學(xué)過程、亞細(xì)胞組分和分子功能。生物學(xué)代謝過程方面，有885個(gè)(87.7%)與代謝相關(guān)的基因上調(diào)，主要包括115個(gè)(11.40%)與代謝過程相關(guān)的基因、109個(gè)(10.80%)與主要代謝過程有關(guān)的基因、105個(gè)(10.40%)與細(xì)胞代謝相關(guān)的基因、88個(gè)(8.72%)與巨分子代謝過程相關(guān)的基因、81個(gè)(8.03%)與細(xì)胞巨分子代謝過程相關(guān)的基因、72個(gè)(7.14%)與含氮復(fù)合物的代謝過程相關(guān)的基因、69個(gè)(6.84%)與細(xì)胞的含氮復(fù)合物的代謝過程相關(guān)的基因、67個(gè)與(6.64%)核酸代謝過程相關(guān)的基因及179個(gè)(17.74%)與細(xì)胞其他代謝過程有關(guān)的基因；下調(diào)的基因主要包括22個(gè)(18.97%)與代謝有關(guān)的基因和21個(gè)(18.10%)與催化活性相關(guān)的基因。在細(xì)胞組分方面，表達(dá)上調(diào)的基因分布比較均勻，表達(dá)上調(diào)最高的為細(xì)胞及細(xì)胞成分相關(guān)基因488個(gè)(29.20%)，其他分別為胞內(nèi)組分相關(guān)基因358個(gè)(21.42%)、膜結(jié)合細(xì)胞器及胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器相關(guān)基因272個(gè)(16.28%)、細(xì)胞膜組分相關(guān)基因117個(gè)(7.00%)；下調(diào)基因主要為細(xì)胞骨架、微管細(xì)胞骨架及相關(guān)組分基因57個(gè)(78.08%)。分子功能方面，表達(dá)上調(diào)的基因中591個(gè)(84.07%)與結(jié)合相關(guān)，主要為蛋白結(jié)合相關(guān)基因91個(gè)(12.95%)、金屬離子結(jié)合相關(guān)基因57個(gè)(8.11%)、陽離子結(jié)合相關(guān)基因57個(gè)(8.11%)及核酸結(jié)合相關(guān)基因53個(gè)(7.54%)；下調(diào)的分子功能相關(guān)基因主要包括44個(gè)(30.77%)水解酶活性相關(guān)基因、17個(gè)(11.89%)酶調(diào)節(jié)活性相關(guān)基因。

2.5Pathway 分析Pathway 分析是一種將基因繪制在KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中的一種功能分析，可以篩選出兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間具有顯著差異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中P值代表Pathway的重要性，P值越低，則表明此Pathway的作用越重要。

本研究中，基因表達(dá)上調(diào)的信號(hào)通路主要包括與小鼠肌肉相關(guān)的信號(hào)通路，如黏蛋白型O-聚糖合成信號(hào)通路、黏多糖合成角質(zhì)硫酸信號(hào)通路、Fanconi貧血信號(hào)通路及胰液分泌信號(hào)通路等；基因表達(dá)下調(diào)的信號(hào)通路主要有血管加壓素信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂信號(hào)通路、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、糖基化磷脂酰肌醇錨合成信號(hào)通路、青春晚期糖尿病信號(hào)通路及嘌呤代謝信號(hào)通路等。

3討論

基因芯片技術(shù)基于核酸分子探針及互補(bǔ)核酸序列之間的特異性結(jié)合，將數(shù)百萬的信息通過微印刷或原位寡核苷酸合成技術(shù)集成到玻璃或硅質(zhì)載體上，通過熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)或放射化學(xué)檢測芯片的雜交結(jié)果，判斷待測目標(biāo)的相對核酸序列含量?；蛐酒哂锌焖佟⒏咄考皹颖居昧可俚奶攸c(diǎn)，能夠快速地對疾病的相關(guān)基因進(jìn)行篩選，并對疾病的分類、預(yù)后、治療提供有用的信息，適用于海量基因序列信息的篩選及分析。它的出現(xiàn)大大加快了基因表達(dá)分析、比較基因組雜交、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測以及蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究。

本研究采用最新的基因組表達(dá)譜芯片(12×135K)， 該芯片包含約44170個(gè)基因，每個(gè)基因分別用3個(gè)探針檢測，基本上涵蓋了目前已知的全部小鼠基因，是分析基因表達(dá)譜的有力工具。我們用該芯片分別檢測T1DM未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠的表達(dá)譜，共得到1007個(gè)差異表達(dá)基因(其中表達(dá)上調(diào)的基因432個(gè)，下調(diào)的基因575個(gè))，為篩選相關(guān)致病基因提供了依據(jù)。

我們對GO分析結(jié)果作餅圖，以生物學(xué)過程，分子功能和亞細(xì)胞組分三個(gè)大類進(jìn)行分析，并標(biāo)示出每一分類中富集明顯的前十個(gè)條目。結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中，表達(dá)上調(diào)的代謝相關(guān)的差異基因占87.7%，主要包括代謝過程、主要代謝過程、細(xì)胞代謝、巨分子代謝過程、細(xì)胞巨分子代謝過程、含氮復(fù)合物的代謝過程、細(xì)胞的含氮復(fù)合物的代謝過程及核酸代謝過程；下調(diào)的代謝相關(guān)的差異基因占 18.97%，主要包括與催化活性相關(guān)的基因。這些結(jié)果提示，胰島細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡等生理過程出現(xiàn)異常，導(dǎo)致胰島細(xì)胞的壞死或凋亡[4]。在細(xì)胞組分方面，表達(dá)上調(diào)的基因分布比較均勻，表達(dá)上調(diào)最高的基因與細(xì)胞及細(xì)胞成分相關(guān)，其余依次為胞內(nèi)組分、膜結(jié)合細(xì)胞器及胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器；表達(dá)下調(diào)的基因主要與細(xì)胞骨架、微管細(xì)胞骨架及相關(guān)組分相關(guān)。這表明，胰島細(xì)胞維持細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的功能下降。在分子功能方面，表達(dá)上調(diào)的基因與結(jié)合有關(guān)的占84.07%，主要為蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、陽離子結(jié)合及核酸結(jié)合；表達(dá)下調(diào)的基因主要與水解酶活性及酶調(diào)節(jié)活性有關(guān)。這表明，參與胰島新陳代謝以及生物調(diào)控的基因表達(dá)下調(diào)。

從Pathway 分析結(jié)果來看，基因表達(dá)上調(diào)的信號(hào)通路主要為小鼠肌肉相關(guān)的信號(hào)通路，包括黏蛋白型O-聚糖合成信號(hào)通路、黏多糖合成角質(zhì)硫酸信號(hào)路及Fanconi貧血信號(hào)通路等；基因表達(dá)下調(diào)的信號(hào)通路主要有血管加壓素信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂信號(hào)通路、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號(hào)通路等。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，T1DM未發(fā)病的NOD小鼠與已發(fā)病的NOD小鼠胰島基因表達(dá)譜明顯不同，在代謝過程和分子功能方面有較大差異。這些關(guān)于T1DM發(fā)病NOD小鼠與未發(fā)病NOD小鼠差異表達(dá)基因的信息為篩選相關(guān)致病基因提供了依據(jù)，以后可從中挑選感興趣的基因或相應(yīng)的蛋白進(jìn)行深入研究，以探尋T1DM診斷和治療的新方向。

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基本項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金(編號(hào)：ZR2010HM041)；山東省臨沂市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(編號(hào)：201413006)

Changes of Gene Expression Profile in Non-Obese Diabetic Mice during the Development of Type 1 Diabetes Mellitus

LIMinSONGLujunGAOXiaodongCHANGWenjuFULiangQINXinyuDepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the genetic changes in non-obese diabetic(NOD) mice during the development of Type 1 diabetes mellitus (T1DM) with gene expression microarrays. Methods: The pancreatic islet cells of NOD mice without or with T1DM were isolated. Total RNA was extracted separately, and hybridized with 12×135K gene expression microarrays (Roche NimbleGen Inc.). NimbleScan software was used for data analysis of gene expression. Results: A total of 1007 differentially expressed genes were obtained from non-diabetic and diabetic NOD mice. The gene ontology(GO) analysis showed that, on aspect of biological processes, 87.7% of the up-regulated genes were associated with metabolism, while 18.97% of the down-regulated genes were associated with metabolism. On aspect of cellular components, 29.20% of the up-regulated genes were associated with cells and cell components, while 78.08% of the down-regulated genes were associated with cytoskeleton and microtubule cytoskeleton. On aspect of molecular function, 84.07% of the up-regulated genes were associated with binding, while 30.77% of the down-regulated genes were hydrolase activity related genes. The pathway analysis showed that the main signaling pathway for up-regulating was mucin type O-Glycan biosynthesis pathway, and the main signaling pathway for down- regulating was vasopressin pathway. Conclusions: There are significant differences in gene expression profile of pancreatic islet cells between NOD mice with T1DM and NOD mice without T1MD.

Key WordsMouse；Type 1 diabetes mellitus；Gene expression microarrays

通訊作者秦新裕，E-mail: 13918126134@163.com 趙孔波，E-mail：zhaokongbo@163.com

中圖分類號(hào)R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A