劉江紅，任靜薇，賈云鵬，楊林峰，于 博，李 航

(1.東北石油大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 石油與天然氣化工省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 大慶 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大慶 城市排水公司，黑龍江 大慶 163318；4.東北石油大學(xué) 數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)學(xué)院,黑龍江 大慶 163318)

響應(yīng)面法優(yōu)化S2菌株的培養(yǎng)條件*

劉江紅1?，任靜薇1，賈云鵬2，楊林峰3，于 博1，李 航4

(1.東北石油大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 石油與天然氣化工省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 大慶 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大慶 城市排水公司，黑龍江 大慶 163318；4.東北石油大學(xué) 數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)學(xué)院,黑龍江 大慶 163318)

利用快速篩選方法從大慶采油三廠油田采出水中篩選出高產(chǎn)生物表面活性劑菌株S2，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬.對(duì)S2菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑進(jìn)行提取及純化后，通過離子鑒別實(shí)驗(yàn)及紅外光譜法對(duì)其進(jìn)行定性檢測(cè)，確定其種類為非離子型脂肽類.以菌種S2產(chǎn)生的發(fā)酵液的乳化指數(shù)(E24)為指標(biāo)，通過響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)S2菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以接種量、pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速為因素優(yōu)化對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn).在此模型的基礎(chǔ)上，通過二次回歸方程得出最佳值是pH為7.2、溫度為43.5 ℃ 、接種量為5.2%(V/V)、搖床轉(zhuǎn)速為162 r/min.在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下，測(cè)得菌株S2所產(chǎn)生發(fā)酵液的最優(yōu)E24為81.20%.

發(fā)酵液；紅外光譜法；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；乳化；菌株

生物表面活性劑是微生物在一定條件下發(fā)酵產(chǎn)生且具有表面活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其性質(zhì)為同時(shí)具有親油性和親水性[1].生物表面活性劑對(duì)疏水性物質(zhì)具有有效的乳化、潤濕、分散、溶解作用，同時(shí)使體系的表/界面張力有所下降[2-3].自然界中存在許多微生物(細(xì)菌、真菌等)，這些微生物能夠在發(fā)酵培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)生不同種類的生物表面活性劑.現(xiàn)在化學(xué)合成的表面活性劑因其造成環(huán)境污染而使其使用面臨著巨大的環(huán)境壓力，生物表面活性劑具有功能的多樣性和對(duì)環(huán)境的友好性，且在食品工業(yè)、原油采出、污染環(huán)境的修復(fù)等領(lǐng)域中起著越來越重要的作用.

作為一種綜合性優(yōu)化方法，響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)合了數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，主要內(nèi)容包括優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面分析和擬合優(yōu)化計(jì)算3部分，被廣泛地應(yīng)用在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化和生化反應(yīng)中[4].本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的應(yīng)用對(duì)生物表面活性劑高產(chǎn)量菌株S2的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以乳化指數(shù)E24為響應(yīng)值，pH值、溫度、接種量及搖床轉(zhuǎn)速為其主要影響因素，通過實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)并分析各因素的最佳條件，從而提高乳化指數(shù).通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?D響應(yīng)曲面圖和等高線圖的分析，可以直觀地得出各因素與乳化指數(shù)E24的響應(yīng)關(guān)系及各因素間交互作用的顯著程度[5-6].采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及模型建立.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 主要設(shè)備

XZD-3型界面張力儀，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；超聲細(xì)胞破碎儀，賽飛(中國)有限公司；薄層色譜層析缸(100×100)，天津市思利達(dá)科技有限公司 ；紅外光譜儀，大塚電子(蘇州)有限公司.

1.1.2 菌株來源

以快速法為篩選方法，從大慶采油三廠的油田采出水中篩選出高產(chǎn)生物表面活性劑純菌種S2，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室一系列生理、生化實(shí)驗(yàn)鑒定后，確定S2菌種為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20 g，mNaNO3=0.5 g，mKH2PO4=1 g，mNa2HPO4=2 g，mMgSO4=0.02 g，mFeSO4=0.01 g，mNaCl=5 g，mCaCl2=0.08 g，pH值為7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的乳化指數(shù)(E24)測(cè)定[7]

將經(jīng)過72 h震蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵液用離心機(jī)去除菌體細(xì)胞，取其5 mL和5 mL液體石蠟混合于比色管中，在100 W的超聲波中進(jìn)行細(xì)胞粉碎處理，待形成白色乳化液后，靜置24 h，測(cè)量E24的公式如式(1)所示.

(1)

1.2.2 發(fā)酵液的表面張力測(cè)定

采用Wihelmy板法對(duì)菌株的發(fā)酵液進(jìn)行表面張力測(cè)定.移取發(fā)酵液10 mL置于直徑為4 cm的培養(yǎng)皿中，發(fā)酵液的表面張力被表面張力測(cè)定儀測(cè)定，在每次測(cè)定前，需將鉑片用蒸餾水沖洗干凈，并用酒精燈對(duì)鉑片進(jìn)行灼燒.以蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn).

1.2.3 生物表面活性劑提取、純化

本實(shí)驗(yàn)采用酸沉淀法進(jìn)行表面活性劑純化.將S2菌株發(fā)酵液在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min后取其上清，上清液用濃鹽酸(2 mol/L)調(diào)節(jié)至pH為2.0，在溫度為4 ℃靜置過夜.靜置后的溶液在相同轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心20 min，棄其上清，用少量蒸餾水重懸沉淀，用濃NaOH調(diào)節(jié)至pH為7.0，樣品于-20 ℃放置5 h后，在真空條件下冷凍干燥24 h.所得的樣品即為該生物表面活性劑的粗品，將其稱重后用無水甲醇進(jìn)行超聲溶解，在14 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min后，取其上清并在46 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā).

1.2.4 生物表面活性劑的定性鑒別實(shí)驗(yàn)

通過亞甲基藍(lán)-氯仿法、酸性溴酚藍(lán)法及濁點(diǎn)法對(duì)提純后的生物表面活性劑進(jìn)行離子鑒別實(shí)驗(yàn).

用KBr壓片法把經(jīng)過甲醇萃取得到的生物表面活性劑純品壓片，利用紅外吸收光譜對(duì)其進(jìn)行測(cè)定.紅外吸收光譜上出現(xiàn)吸收峰對(duì)應(yīng)的波長范圍可用來判斷其相應(yīng)的官能團(tuán)，進(jìn)而確定該樣品的分子結(jié)構(gòu).

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行4因素3水平(分別以-1，0，+1編碼)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，各因素的實(shí)驗(yàn)水平及編碼如表1所示.29組實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可以分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，為了更好地估算實(shí)驗(yàn)中可能存在的誤差，需要重復(fù)進(jìn)行5次零點(diǎn)實(shí)驗(yàn).

Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中具體的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置如表2所示.通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的二次回歸擬合分析得到各因素與響應(yīng)值間的回歸方程，分析各因素與響應(yīng)值間的主效應(yīng)、因素間的交互效應(yīng)得到最佳響應(yīng)值.

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 生物表面活性劑的定性鑒別實(shí)驗(yàn)

2.1.1 生物表面活性劑的離子鑒別實(shí)驗(yàn)

觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為陰離子鑒別實(shí)驗(yàn)中氯仿層顯無色，陽離子鑒別實(shí)驗(yàn)中溶液不變色，非離子鑒別實(shí)驗(yàn)中溶液內(nèi)有新相生成.通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知S2菌株所產(chǎn)生物表面活性劑種類為非離子型.

2.1.2 紅外光譜分析

由圖1分析可知，生物表面活性劑在3 300 cm-1～3 200 cm-1有一個(gè)較寬的吸收峰，其分子具有鍵C-H和N-H的伸縮振動(dòng)，表示該物質(zhì)是含有氨基的碳?xì)浠衔锊⑶掖嬖诜肿觾?nèi)氫鍵.此外在2 927 cm-1,2 896 cm-1和2 358 cm-1處有3個(gè)較強(qiáng)吸收峰，表示該物質(zhì)含有C-CH3鍵或是含有長烷基.在6 654 cm-1處擁有最強(qiáng)吸收峰，表示該生物表面活性劑分子含有肽鍵，分子內(nèi)的C=O鍵伸縮振動(dòng)引起與此處相鄰的1 532 cm-1的另一強(qiáng)吸收.由紅外譜圖可知，S2菌株發(fā)酵產(chǎn)生的生物表面活性劑具有與脂肽類基本一致的特征吸收峰.

波數(shù)/cm-1

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型分析

應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分析后得到4個(gè)因素與乳化指數(shù)E24之間的二次擬合回歸方程(A：pH值，B：溫度，C：接種量，D：搖床轉(zhuǎn)速)：

Y(E24)=-675.78+126.81A+9.23B+

12.39C+0.80D-0.001 7AB-0.11AC+

0.001 6AD-0.002 5BC+0.000 3BD+

0.017CD-8.77A2-0.11B2-1.37C2-

0.002 8D2．

(2)

由表3可看出，本實(shí)驗(yàn)所選用模型的P值<0.000 1具有高度的顯著性；該模型的單因素中A(pH值)、B(溫度)、C(接種量)對(duì)響應(yīng)值(E24)的影響顯著，F(xiàn)pH= 340.24 >F溫度= 142.33 >F接種量= 6.66 >F搖床轉(zhuǎn)速= 0.35，二次項(xiàng)A2,B2,C2和D2的影響也十分顯著.該模型的失擬率僅為0.01%，表明分析得到的回歸方程符合實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，可用該方程代替真實(shí)函數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和探究.

表3 回歸模型的方差分析

表4 回歸模型的可信度分析

2.3 菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

利用軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合后，得到本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?D響應(yīng)曲面及等高線圖，通過分析研究可以得到各因素之間的交互作用并且確定其最優(yōu)值.兩因素間交互作用的顯著程度被等高線圖直觀地反映出，即交互作用顯著呈橢圓形，不顯著呈圓形.故由等高線圖可知pH值和接種量、pH值和搖床轉(zhuǎn)速、溫度和搖床轉(zhuǎn)速、溫度和接種量、接種量和搖床轉(zhuǎn)速兩因素的交互作用顯著.

由圖2中的3D響應(yīng)曲面可知，A，B，C和D存在極值點(diǎn)，利用Design Expert軟件，對(duì)乳化指數(shù)E24(Y)的二次多項(xiàng)式模型解逆矩陣可知，響應(yīng)值Y越大越好.經(jīng)軟件分析或回歸方程求導(dǎo)得到優(yōu)化結(jié)果，可得A，B，C和D對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)值A(chǔ)=7.2，B=43.5 ℃，C=5.2%，D=162 r/min.在此培養(yǎng)條件下，分析后響應(yīng)值Y達(dá)最大值，預(yù)測(cè)Ymax=78.86%.

(a) 3D響應(yīng)曲面圖

(b) 等高線圖

2.4 追加實(shí)驗(yàn)

在響應(yīng)面分析得到的S2菌株最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn)，通過追加實(shí)驗(yàn)測(cè)得：由S2菌產(chǎn)生的生物表面活性劑的最佳E24為81.20%，較Abouseoud[8]得到的65%與Ansari[9]得到的70%有了很大的提高；S2菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑的最佳產(chǎn)量為1.26 g/L(不在最佳條件下測(cè)得生物表面活性劑產(chǎn)量為0.72 g/L)；S2菌株的發(fā)酵液的表面張力從72.0 mN/m減少至25.8 mN/m.

3 結(jié) 論

通過離子鑒別實(shí)驗(yàn)及傅里葉紅外光譜分析法對(duì)高產(chǎn)生物表面活性劑菌株S2產(chǎn)生的生物表面活性劑進(jìn)行定性檢測(cè)，確定其為非離子型脂肽類.采用響應(yīng)面法進(jìn)行了S2菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通

過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和Design Expert 8.0.5軟件分析確定出主要影響因素的最優(yōu)值，即pH為7.2、溫度為43.5 ℃、接種量為5.2%(V/V)、搖床轉(zhuǎn)速為162 r/min.由因素實(shí)驗(yàn)水平和顯著性分析可知，pH值、溫度、接種量對(duì)S2菌株產(chǎn)生發(fā)酵液的乳化指數(shù)E24有顯著影響，其中pH值對(duì)其影響最大.在最佳培養(yǎng)條件下，S2菌株所產(chǎn)生物表面活性劑的最佳E24為81.20%、生物表面活性劑的產(chǎn)量從0.72 g/L增加至1.26 g/L、發(fā)酵液的表面張力從72.0 mN/m減少至25.8 mN/m.模型的實(shí)驗(yàn)值接近回歸方程計(jì)算得到的預(yù)測(cè)值，說明該回歸方程能夠反映實(shí)際情況中各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，故采用響應(yīng)面法優(yōu)化S2菌株的培養(yǎng)條件具有高效性和可行性.

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Optimization of Culture Conditions of S2 Strain by Response Surface Method

LIU Jiang-hong1?, REN Jing-wei1, JIA Yun-peng2, YANG Lin-feng3, YU Bo1,LI Hang4

(1. Provincial Key Laboratory of Oil and Gas Chemical Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering, Northeast Petroleum Univ, Daqing ，Heilongjiang 163318 China；2.Research Institute of Petroleum Engineering, Dagang Oilfield,Tianjin 300280 China；3.Daqing Urban Drainage Company, Daqing, Heilongjiang 163318, China；4.College of Mathematics and Statistics, Northeast Petroleum Univ， Daqing， Heilongjiang 163318,China )

S2 strain that highly produces biosurfactant was screened from the oilfield water of three plants in Daqing Oilfield in the rapid screening method, and the S2 strain was identified as Bacillus sp.. Through FT-IR and ion identification test, S2 biosurfactant was identified as nonionic lipopeptide biosurfactant. This experiment treated emulsification index (E24) of S2 strain fermentation broth as the object. Through response surface optimization method, the culture conditions (inoculum, pH, temperature and rotation speed) of the S2 strain were optimized. On the basis of response surface model, the optimum pH value was 7.2 and the temperature was 43.5 ℃, inoculation of 5.2% (V/V), rotation speed was 162 r/min through the quadratic regression equation. Under the optimal condition, the bestE24of S2 strain fermentation broth was 81.20%．

fermentation broth; infrared spectral measurements; response surface experiments; emulsification; strain

1674-2974(2015)06-0096-05

2014-06-30

黑龍江省教育廳科技公關(guān)項(xiàng)目(12531064)

劉江紅(1966-)，女，黑龍江綏化人，東北石油大學(xué)教授

?通訊聯(lián)系人，E-mail:ljhread@126.com

TE357

A