婁彬彬 ，滿朝新，費(fèi) 鵬，牛婕婷，李 然，柴云雷，李 理，姜毓君，

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)/國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028)

阪崎克羅諾桿菌是一種含周身鞭毛、能運(yùn)動(dòng)并兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢的粗短桿菌。目前克羅諾桿菌屬有7 個(gè)種［1，2］，包括阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌(C.malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌 (C.turicensis)、穆汀斯克羅諾桿菌(C.muytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis)、傳奇克羅諾桿菌 (C.universalis)、調(diào)味品克羅諾桿菌(C.condimenti)。阪崎克羅諾桿菌是重要的食源性條件致病菌，能夠引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎［3］、壞死性小腸結(jié)腸炎［4］和菌血癥［5］。該菌能分離自廣泛的食品來源(包括肉、奶酪、蔬菜、藥草、調(diào)料和嬰幼兒配方粉等)［6，7］、環(huán)境、以及昆蟲［8，9］。

傳統(tǒng)的生化鑒定方法(如API20E)，表現(xiàn)出了很大的局限性，如重復(fù)性差、分辨力低、易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等。因此，依據(jù)細(xì)菌遺傳性特征的分子分型(亦稱基因分型)技術(shù)逐步應(yīng)用于致病菌的溯源分析及數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建中。本研究利用核糖體分型中以16sRNA 基因序列為研究對(duì)象，其在生物體中種類少，含量較多，存在與所有細(xì)胞中，功能同源且最為古老，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)［10］?？赏ㄟ^對(duì)保守序列設(shè)計(jì)通用引物可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的鑒定，對(duì)可變序列設(shè)計(jì)特異性引物，用于檢測(cè)菌種或菌屬間的差異并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類。本研究利用16S rDNA 基因測(cè)序的方法對(duì)37 株阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定和分型，鑒定結(jié)果表明細(xì)菌在分子水平上的鑒定較生化鑒定具有更好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析并根據(jù)序列同源性比對(duì)，可將所有菌株進(jìn)行分型，這表明16S rDNA 基因測(cè)序可以對(duì)阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分型，并進(jìn)一步揭示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。說明16S rDNA基因測(cè)序能夠?qū)嫫榭肆_諾桿菌進(jìn)行鑒定和分型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

37 株阪崎克羅諾桿菌，分離自2009—2012年期間不同地區(qū)生產(chǎn)的乳粉和嬰幼兒配方粉樣品及某一濕法加工嬰幼兒配方粉生產(chǎn)企業(yè)的加工環(huán)境和成品的分離菌株，以及來自實(shí)驗(yàn)室間菌株交換和相關(guān)單位的贈(zèng)送的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.2 試劑與儀器

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司;SeaKem Gold 瓊脂糖，美國(guó)Amresco 公司;引物，北京invitrogen 公司合成;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，青島海博生物有限公司;Bcn1360 型生物超凈工作臺(tái):上海佳勝儀器制造有限公司;9700 PCR 擴(kuò)增儀:美國(guó)Applied Biosystems 公司;DYY-10C 型電泳儀:北京市六一儀器廠;UVP 凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)UVP 公司;TGC-16G 型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;高壓蒸汽滅菌鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司;DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)、活化與純化

取出-80 ℃甘油保存的含有阪崎克羅諾桿菌的凍存管，將菌株恢復(fù)至室溫后，按2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8～12 h 進(jìn)行活化。用接種環(huán)蘸取活化后的菌液于TSA 平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。使平板上長(zhǎng)出阪崎克羅諾桿菌單菌落，已達(dá)到純化的目的。

1.3.2 基因組總DNA 的提取

挑取TSA 平板中的單菌落，在LB 培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。取2mL 培養(yǎng)液，進(jìn)行阪崎克羅諾桿菌全基因組提取，采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，具體操作步驟參照試劑盒說明。

1.3.3 16S rDNA 序列的擴(kuò)增

阪崎克羅諾桿菌16S rDNA 序列擴(kuò)增:采用16S rDNA 通用引物27f:‘5-AGTCTCTGATCATGC-CTCAG-3’和1492r:‘5-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3’。擴(kuò)增體系為50μL:10 × Buffer (含MgCl2)，5.0 μL;dNTPs (10 mmol/L)，2.0μL;引物27f (10 μmol/L)，1.0 μL;引物1 492r (10 μmol/L)，1.0μL;Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U/μL)，1.0μL;DNA 模板 (20～50 ng)，2.0μL，補(bǔ)加ddH2O 至50μL。

PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;循環(huán)數(shù)為30 個(gè);72℃終延伸5 min;將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠(含EB)上進(jìn)行電泳檢測(cè)，100 V 電壓和100 A 電流電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，檢測(cè)是否有擴(kuò)增條帶和條帶大小。

1.3.4 16S rDNA 序列的測(cè)序

將所有菌株的16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和引物，送到上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas 1.45 軟件進(jìn)行查閱，用DNAMAN 5.29 軟件將雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行剪切與拼接，并將拼接后的序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 序列比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)分離菌株的鑒定。從GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中提取IVERSEN 等遞交的克羅諾菌屬的相關(guān)菌種和亞種的模式菌株及腸桿菌屬的相關(guān)菌株的16S rDNA 序列作為參比，利用MEGA 4 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組總DNA 的提取與鑒定

將試驗(yàn)菌株參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，提取基因組總DNA。將提取后的產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠(含EB)上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖1。

圖1 試驗(yàn)菌株基因組總DNA 提取電泳圖

由圖1 可知，基因組DNA 條帶清晰單一、無雜帶，可知DNA 提取效果良好，可作為模板進(jìn)行后續(xù)16S rDNA 序列擴(kuò)增。

2.2 16S rDNA 序列的擴(kuò)增

采用通用引物27f 和1492r 對(duì)菌株16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果圖2 所示。

圖2 試驗(yàn)菌株16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖

由圖2 可知，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一明亮，且大小在1 500 bp 左右，與目的條帶大小一致。說明產(chǎn)物為16S rDNA 序列擴(kuò)增產(chǎn)物，可送去測(cè)序。

2.3 16S rDNA 序列的測(cè)定

將37 株分離菌株的16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和引物，送到上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用軟件剪切和拼接后，將序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，所有菌株(包括ES59)除了ES4 外，其余菌株與Cronobacter sakazakii 的同源性最高，相似性達(dá)99%，而ES4 的比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與Citrobacter freundii 的同源性最高，達(dá)99%，因此ES4 被鑒定為弗氏檸檬酸桿菌，其余36 株菌株均鑒定為阪崎克羅諾桿菌。這一說明表明除菌株ES4 外，其余66 株分離菌株均鑒定為阪崎克羅諾桿菌。以分離菌株ES1 為例，經(jīng)Blast 比對(duì)后得到的分值較高的菌株為Cronobacter sakazakii，且相似性達(dá)99% (附表)，其他菌株的同源性分析結(jié)果與ES1 相似。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

附表 分離菌株ES1 在GenBank 中同部分16S rDNA 序列同源性比對(duì)結(jié)果

2.4 16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及分析

因菌株ES4 被鑒定為弗氏檸檬酸桿菌，所以不參與后續(xù)試驗(yàn)分析。利用MEGA 4.1 軟件對(duì)36 株分離菌株、阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，克羅諾菌屬的相關(guān)菌種和亞種的模式菌株(包括蘇黎世克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌)及腸桿菌屬的相關(guān)菌株(包括大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌)，共計(jì)50 株菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，參數(shù)設(shè)置為鄰接相鄰算法，Kimura 2-parameter 模式，重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示所有菌株被分成五個(gè)類群(Group I～Group V)，其中分離菌株與阪崎克羅諾桿菌ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株(除ATCC51329)在同一系統(tǒng)發(fā)育分支Group I，說明親緣關(guān)系最近，這與鑒定結(jié)果相符。克羅諾桿菌屬的其它菌種組成Group II 類群，ATCC51329 呈單一分支，為Group III。此外，大腸埃希氏菌和大腸埃希氏O157 屬于Group IV，產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌屬于Group V。對(duì)Group I 中菌株進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株間的相似度為97.35%，有研究學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)16S rDNA 序列的相似度小于98.3 %時(shí)，可以對(duì)該組群進(jìn)一步分型［11］。

在阪崎克羅諾桿菌的分支下可分成7 個(gè)子群，子群1 包含10 株分離菌株和1 株ATCC12868，它們之間的相似性為98.51%;子群2 含有5 株分離菌株和1 株ATCC29544，群內(nèi)相似性為98.30%;子群3 包含6 株分離菌株和1 株ATCC29004，群內(nèi)相似性為98.37%;子群4 包含8 株分離菌株和1 株ATCCBAA-894，群內(nèi)相似性為98.82%;子群5 只含有一株菌株ES53;子群6 和7 分別含有3 株分離菌株和4 株分離菌株，它們的群內(nèi)相似性分別為98.34%和98.46%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用API20E 鑒定為阪崎克羅諾桿菌的ES4 被進(jìn)一步鑒定為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，其余分離菌株的16S rDNA 序列與Cronobacter sakazakii 的同源性最高，相似性達(dá)99%，鑒定為阪崎克羅諾桿菌。這表明基因水平的鑒定具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，具有更好的靈敏性，較優(yōu)于傳統(tǒng)生化反應(yīng)的鑒定。此外利用MEGA 4.1 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，所有分離菌株位于同一類群中(Group I)，依據(jù)群內(nèi)菌株間基因序列的同源性比對(duì)，又將Group I 中的菌株分成7 個(gè)子群，這說明16S rDNA 測(cè)序具有一定的分型能力，可以幫助我們更好的了解不同克羅諾桿菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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