梁君妮，尹偉力，劉 寧，許紅巖

(煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000)

弧菌廣泛分布于淡水環(huán)境和海水環(huán)境，許多研究表明，有多種弧菌是魚類的重要條件性病原菌，主要包括鰻弧菌、燦爛弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻膠弧菌和哈維氏弧菌等[1]。其中鰻弧菌引起的疾病最為嚴重，在世界范圍流行。鰻弧菌也是我國海水養(yǎng)殖魚類重要的條件致病菌。李清祿等從網箱養(yǎng)殖發(fā)病的大黃魚體內分離到2 株鰻弧菌[2]。肖慧等從發(fā)生爛鰓、爛尾病的鱸魚體內分離到鰻弧菌[3]。莫照蘭等從患病的牙鲆體內分離到一株鰻弧菌[4]。研究表明分離出的鰻弧菌均具有致病性。

賴解旋酶DNA 恒溫擴增技術(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)是模擬自然界生物體內DNA 復制的自然過程，在恒溫條件下利用解旋酶解開DNA 雙鏈，同時DNA 單鏈結合蛋白(SSB)穩(wěn)定解開的單鏈，為引物提供結合模板，由DNA 聚合酶催化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入上述的循環(huán)擴增反應，最終實現靶序列的指數式增長[5-6]。HDA 技術操作簡單，具有良好的應用前景，特別適用于現場診斷產品的開發(fā)，目前已應用于一些病原菌的檢測。本實驗選取鰻弧菌的toxR 基因作為檢測靶基因，設計特異性引物，建立快速檢測鰻弧菌的HDA 新方法。

1 材料和方法

1.1 菌株及臨床樣品 實驗所用的標準菌株購自美國典型菌種保藏中心；分離菌株由本實驗室分離鑒定并保存，共計16 株(表1)。所有菌株均保存在含15 %甘油緩沖液的保種管中，-80 ℃冰箱保存。所用的臨床樣品均購自市場。

表1 實驗用標準菌株和分離菌株Table 1 Standard and isolated strains for experiment

1.2 主要試劑 TINAamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA 提取試劑盒購自Promega 公司；DNA Marker、Bst polymerase 和MutL protein 購自寶生物工程(大連)有限公司；腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、dNTPs、大腸桿菌UvrD 解旋酶、海藻糖購自上海富眾生物科學有限公司；T4 噬菌體基因32 編碼蛋白(T4 gp32)購自New England 公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 引物設計與合成 根據NCBI 中登錄的鰻弧菌的toxR 基因序列，經B1ast 比對，采用Primer Premier 5.0 軟件設計一對特異性擴增引物：P1：5'-AA CGAGCCTGAAGAGGAA-3'/P2：5'-AACGAGCCTGA AGAGGAA-3'。預期擴增片段為98 bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 實驗菌株基因組DNA的提取 按傳統培養(yǎng)方法分別增菌培養(yǎng)表1 中實驗菌株。分別取實驗菌株的細菌培養(yǎng)液1 mL，根據細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書方法提取細菌DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細菌16S rDNA的PCR擴增 選用細菌的16S rDNA 基因片段的通用引物(F：5'-CCTACGGGA GGCAGCAG-3'/R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')對提取的不同菌株DNA 進行PCR 擴增。預期擴增片段為250 bp。

1.6 HDA反應體系的建立 反應體系為50 μL，采用兩步法反應：反應液I：2 μL 模板DNA，20 pmol引物，ddH2O 補至25 μL。反應液Ⅱ：5 μL 10×buffer B[350 mM Tris-HAc(pH7.5)、100 mM 二硫蘇糖醇、1 mg/mL BSA、100 mM MgSO4]，150 nmol ATP，20 nmol dNTPs，5 U Bst ploymerase，100 ng大腸桿菌UvrD 解旋酶，600 ng MutL protein，4.5 μg T4 gp32，25 μM 海藻糖，用ddH2O 補至25 μL。

反應液I 在95 ℃中水浴5 min，55 ℃水浴退火3 min，將反應液Ⅱ加入反應液I 混勻，置65 ℃恒溫擴增90 min。產物經2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 HDA特異性試驗 采用已建立的HDA 方法對表1 中所列的鰻弧菌等實驗菌株DNA 按照1.6 HDA 擴增條件進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 HDA靈敏度試驗

1.8.1 標準菌株靈敏度檢測試驗 利用分光光度計檢測鰻弧菌標準菌株ATCC45843 的DNA 濃度，TE緩沖液進行10 倍梯度稀釋，對各個稀釋度樣品進行HDA 擴增，經2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定靈敏度。

1.8.2 人工污染模擬樣品靈敏度檢測試驗 將鰻弧菌標準菌株ATCC45843 的培養(yǎng)液用TE 緩沖液進行10 倍梯度稀釋，對各個稀釋度進行平板計數(36.5 ℃培養(yǎng)48 h 后計數)，同時將稀釋液分別接種到含10 g碎魚肉中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后提取DNA 進行HDA擴增，產物經2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定靈敏度。

1.8.3 HDA 方法與普通PCR 方法敏感性比較試驗利用建立的HDA 方法與普通PCR 對1.8.1 和1.8.2中鰻弧菌的DNA 各稀釋度樣品進行檢測，采取相同反應體積和引物，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較兩種方法的敏感性。

1.9 臨床樣品鰻弧菌的檢測 利用已建立的HDA方法和PCR 方法對120 份魚類樣品進行檢測。稱取120 份魚類樣品各10 g，加入90 mL 培養(yǎng)基，勻漿，28 ℃培養(yǎng)24 h，提取DNA，進行HDA 和PCR 擴增，產物經2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較兩種方法的符合率，并與普通細菌培養(yǎng)法進行比較。

2 結果

2.1 細菌16S rDNA基因的PCR擴增 采用細菌16S rDNA 基因通用引物對所有菌株的DNA 進行PCR 擴增，結果表明提取得到所有的菌株DNA，完全符合實驗要求(圖1)。

圖1 所有菌株通用引物PCR 擴增結果Fig.1 The amplification of 16S rDNA fragment from all tested bacteria with universal primers

2.2 特異性試驗 利用建立的HDA 對所有實驗菌株DNA 進行擴增，結果顯示僅對鰻弧菌標準株及分離株的擴增結果呈陽性，在約100 bp 處出現明顯的DNA 擴增片段(圖2)，其余菌株的擴增結果均為陰性。表明該HDA 方法對于鰻弧菌具有良好的特異性。

圖2 HDA 方法檢測鰻弧菌的特異性Fig.2 The specific test of the HDA for V.anguillarum detection

2.3 靈敏度試驗

2.3.1 標準菌株檢測靈敏度試驗 鰻弧菌標準菌株原液提取的DNA 經分光光度計檢測為30 μg/mL，利用建立的HDA 方法和普通的PCR 方法擴增不同稀釋度的鰻弧菌標準菌株的DNA，結果顯示，兩種方法的最低檢出量均為30 ng/mL(圖3)。

圖3 標準菌株HDA 方法(A)和PCR 方法(B)的敏感性試驗Fig.3 Sensitivity tests of HDA(A)and PCR(B)on standard strains

2.3.2 人工污染模擬樣品檢測靈敏度試驗 將鰻弧菌標準菌株10 倍梯度稀釋后計數，各梯度菌懸液含菌量分別為：2.1×106cfu/mL、2.1×105cfu/mL、2.1×104cfu/mL、2.1×103cfu/mL、2.1×102cfu/mL、2.1×101cfu/mL、2.1×100cfu/mL。利用建立的HDA 方法和普通的PCR 方法對各濃度梯度的人工污染的模擬樣品DNA 進行擴增，結果顯示，兩種方法對樣品添加菌的最低檢出限均為2.1×102cfu/mL。

圖4 人工污染樣品HDA 方法(A)和PCR 方法(B)的敏感性試驗Fig.4 Sensitivity tests of HDA(A)and PCR(B)about artificially strains

2.4 臨床樣品鰻弧菌的檢測 利用建立的HDA法、普通PCR 法和細菌培養(yǎng)法對從市場上采購的40 種共120 份魚類樣品(每種類取3 份樣品)進行檢測，結果顯示，細菌培養(yǎng)法檢出陽性率為10.8 %(13/120)；HDA 方法和普通PCR 檢測的陽性率均為20.8 %(25/120)，兩者符合率為100 %，并且檢出率均遠高于細菌培養(yǎng)法。

3 討論

HDA技術作為一種新型的核酸恒溫擴增技術，不僅引物設計簡單、靈敏特異而且操作簡便，僅需要恒溫水浴槽就能進行反應，幾乎融匯了PCR 法和LAMP 方法的優(yōu)點。王建廣等利用HDA 法對沙門氏菌進行了檢測，最低檢測限為460 pg/反應，與普通PCR 相當[7]；石琰璟等通過HDA 法對副溶血性弧菌進行了檢測，最低檢測限為19.9 ng/mL，與普通PCR 相當[8]。美國NEB 公司已經開發(fā)出一系列基于HDA 技術的反應試劑盒，展現出良好的應用前景[9]。

toxR 基因廣泛分布于弧菌中。龐玲玲建立了利用toxR 鑒定哈氏弧菌的PCR 方法[10]，Bauer 和RorviK 利用toxR 基因設計了通用引物進行副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌的同步PCR(mPCR)檢測[11]，許拉等利用toxR 基因建立了同時檢測4 種弧菌和兩種病毒的mPCR 方法[12]，而Neogi 等利用toxR 和vvhA 兩個基因建立了檢測霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的mPCR 體系[13]，并對環(huán)境樣品進行了檢測。因此，本研究也采用鰻弧菌的toxR 基因作為檢測靶基因，自行設計特異性引物，建立了快速檢測鰻弧菌的HDA 檢測方法。

為驗證本研究建立的HDA 方法的特異性，對實驗室分離的6 株陽性菌株進行了檢測，檢測結果均為陽性，并對120 份魚類樣品進行檢測，陽性檢出樣品25 個。為了保證所建方法的靈敏度，以建立的HDA 檢測方法與普通的細菌培養(yǎng)法及PCR 檢測方法進行了對比，結果顯示，HDA 方法檢出率與PCR 方法一致，高于傳統的細菌培養(yǎng)法。本研究建立的HDA 檢測方法有望成為魚類細菌病的日常檢測手段。

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