邵信媛，朱鵬陽，羅維玉，趙玉輝，梁立濱，姜 麗，陳化蘭，胡永浩，李克生*，李呈軍*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒(AIV)引起的禽類全身性或呼吸道性傳染病的總稱。其中，H5N1 屬于高致病性AIV(HPAIV)，其流行嚴(yán)重威脅著養(yǎng)禽業(yè)及人類的健康。

AIV 為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒，其基因組分為8 個(gè)節(jié)段，可以編碼10 種蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2)。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS2 由基因節(jié)段8 編碼，分子量約14 ku。在病毒感染后期，NS2 在細(xì)胞核內(nèi)與病毒核糖核蛋白復(fù)合體(vRNP)和M1 蛋白之間形成vRNP-M1-NS2 鏈?zhǔn)綇?fù)合體，并與細(xì)胞的CRM1 蛋白相互作用，介導(dǎo)vRNP 復(fù)合體輸出細(xì)胞核[1]。此外，NS2 蛋白可以與流感病毒聚合酶復(fù)合體的PB2 和PB1 蛋白結(jié)合，促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制。通過調(diào)控病毒復(fù)制過程中聚合酶的活性，NS2 蛋白對(duì)H5N1 AIV 在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)的適應(yīng)過程中具有重要意義[2]。還具有增強(qiáng)M1 蛋白的穩(wěn)定性和促進(jìn)病毒的包裝與釋放[3-4]。但關(guān)于NS2 的研究鮮有報(bào)道。

本研究以H5N1 AIV 的NS2 蛋白作為“誘餌”蛋白，利用酵母雙雜交(Yeast two-hybrid，Y2H)篩選人的4 種細(xì)胞系的混合cDNA 文庫，篩選鑒定到與NS2 相互作用的宿主蛋白PRDX3。免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)兩者之間在293T 細(xì)胞中存在特異性的相互作用，為進(jìn)一步研究NS2 蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 含有Calu-3、A549、THP-1 和U251 4 種細(xì)胞系的cDNA 文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；質(zhì)粒pGEX-6p-1、pEGFP、pCAGGS-和Y2H 系統(tǒng)有關(guān)的試劑及各種缺陷型培養(yǎng)基均購(gòu)自Clontech 公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α 均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Platinum Pfx DNA 聚合酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX and Plus Reagent 均購(gòu)自Invitrogen 公司；限制性內(nèi)切酶、Pierce IP Lysis Buffer 均購(gòu)自Thermo scientific 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega 公司；Protein Marker 購(gòu)自Fermentas公司；家兔抗Myc 標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)、小鼠抗GFP MAb、家兔抗GFP MAb 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；IRDye800CW 山羊抗兔IgG 抗體和山羊抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自LI-COR Bioscience 公司。

1.2 酵母誘餌重組質(zhì)粒p GBKT7-H5NS2的構(gòu)建根據(jù)A/Anhui/02/2005(H5N1)NS2 基因(簡(jiǎn)稱H5NS2)序列(CY098581.1)設(shè)計(jì)基因特異引物，上、下引物分別引入Eco RⅠ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn)，PCR 擴(kuò)增目的基因，經(jīng)Eco RⅠ/Bam HⅠ雙酶切后克隆于pGBKT7中，構(gòu)建pGBKT7-H5NS2 誘餌重組質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.3 誘餌重組質(zhì)粒酵母菌的轉(zhuǎn)化 采用標(biāo)準(zhǔn)的醋酸鋰法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGold，按照Clontech公司說明書提供的方法將pGBKT7-H5NS2 轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold 感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 誘餌質(zhì)粒自激活的檢測(cè) 將含有pGBKT7-H5NS2/Y2HGold 重組酵母菌，分別劃線接種于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu、SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu/A/X-a-gal 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1 周，觀察誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu 培養(yǎng)基上是否生長(zhǎng)以及是否在SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu/A/X-a-gal 培養(yǎng)基上有藍(lán)色克隆生長(zhǎng)，是否存在自激活作用。

1.5 目的蛋白的篩選 按照雙雜交系統(tǒng)說明書，將pGBKT7-H5NS2/Y2HGold 與4 種細(xì)胞系的Y187 cDNA 文庫進(jìn)行雜交后挑取陽性候選菌落。挑取的陽性候選菌落進(jìn)行酵母質(zhì)粒提取，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α 中提取質(zhì)粒。

對(duì)篩選的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析后，利用NCBI 的在線工具Vectorscreen 除去目的片段兩端所含部分載體序列，經(jīng)BLAST(Basic local alignment search tool，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析和比對(duì)，明確序列代表的基因信息。

1.6 共轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 將篩選的酵母陽性重組質(zhì)粒與pGBKT7-H5NS2 共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌Y2HGold，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照pGBKT7+pGADT7、自激活對(duì)照pGBKT7+重組捕獲質(zhì)粒、陽性對(duì)照pGBKT7-p53+pGADT7-T 和陰性對(duì)照pGBKT7-Lamin+pGADT7-T，以排除假陽性。

1.7 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-H5NS2的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)H5NS2 序列設(shè)計(jì)基因特異引物，PCR 擴(kuò)增目的基因后，將其通過Eco RⅠ/Bam HⅠ克隆于pEGFP-C1 中，構(gòu)建pEGFP-H5NS2 重組質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.8 真核表達(dá)重組質(zhì)粒p CAGGS-myc-PRDX3的構(gòu)建及鑒定 設(shè)計(jì)引物，以A549 細(xì)胞系cDNA 為模板，擴(kuò)增PRDX3 基因，將其通過Eco RⅠ/XhoⅠ克隆于pCAGGS 中，構(gòu)建pCAGGS-myc-PRDX3 重組質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.9 Co-IP試驗(yàn) 按轉(zhuǎn)染試劑盒方法將pEGFP-C1和 pCAGGS-myc-PRDX3 或 pEGFP-C1-H5NS2 和pCAGGS-myc-PRDX3 共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，收集細(xì)胞裂解物上清，取少量樣品處理后進(jìn)行western blot 檢測(cè)，其余樣品進(jìn)行Co-IP 試驗(yàn)。Co-IP 試驗(yàn)流程如下：首先在剩余樣品內(nèi)加入小鼠抗GFP MAb，4 ℃感作12 h 后加入Dynabeads Protein G 磁珠，4 ℃繼續(xù)感作6 h。以預(yù)冷的IP 裂解液洗滌4～6 次，加入適量IP 裂解液重懸磁珠進(jìn)行SDS-PAGE，采用兔抗Myc MAb、兔抗GFP MAb對(duì)免疫沉淀復(fù)合物中的組分進(jìn)行western blot 檢測(cè)。

1.10 GST pull-down試驗(yàn) 將H5NS2 基因克隆于pGEX-6p-1 中，并在大腸桿菌中表達(dá)制備GSTH5NS2 重組蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白。將pCAGGSmyc-PRDX3 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞中的蛋白樣品用于pull-down 試驗(yàn)。pull-down 試驗(yàn)流程如下：將GST-H5NS2 樹脂與Myc-PRDX3 混合，同步設(shè)立GST 樹脂與Myc-PRDX3 對(duì)照，置于4 ℃感作6 h。用裂解液洗去未結(jié)合的蛋白，加入適量裂解液重懸樹脂進(jìn)行SDS-PAGE，以家兔抗Myc MAb進(jìn)行western blot 檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選與NS2蛋白相互作用的宿主蛋白及其功能分析 將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-H5NS2 轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold，重組菌能夠在SD/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)狀態(tài)與其他各對(duì)照組無明顯差異，表明該誘餌質(zhì)粒無細(xì)胞毒性；重組菌不能在SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu 上生長(zhǎng)以及在SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu/A/X-α-gal 培養(yǎng)基上無藍(lán)色克隆生長(zhǎng)，表明該誘餌質(zhì)粒不存在自激活現(xiàn)象。酵母雙雜交篩選結(jié)果顯示被捕獲的蛋白為HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9 和RMND5B。Gene Ontology(GO)分析結(jié)果顯示篩選得到的7 種宿主蛋白分別參與細(xì)胞代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞組織間的相互作用和細(xì)胞定位等(表1)。

表1 與NS2 蛋白相互作用蛋白GO 分析Table 1 Bioactivity profile of the NS2-interacting proteins based on GO analysis

2.2 酵母共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證NS2蛋白與PRDX3的相互作用 自激活試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pGADT7-PRDX3(AD-PRDX3)不存在自激活現(xiàn)象，并且對(duì)酵母細(xì)胞無毒性，能夠排除結(jié)果的假陽性。將BD-NS2 與AD-PRDX3 共轉(zhuǎn)化至酵母菌Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu 和SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu/A/X-α-gal 培養(yǎng)平板上，這菌株在3 種不同的缺陷型培養(yǎng)基上均能夠正常生長(zhǎng)并分解底物X-α-Gal 而使菌落變藍(lán)。結(jié)果表明，在酵母系統(tǒng)中NS2 蛋白與PRDX3 存在相互作用(圖1)。

2.3 Co-IP驗(yàn)證NS2與PRDX3的相互作用 在293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pEGFP-C1 和pCAGGS-myc-PRDX3 或pEGFP-C1-H5NS2 和pCAGGS-myc-PRDX3質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h 裂解細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP 及western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，帶有EGFP 標(biāo)簽的H5NS2 和帶有myc 標(biāo)簽的PRDX3 在293T 細(xì)胞中均可以表達(dá)，利用小鼠抗GFP MAb 進(jìn)行免疫共沉淀后，進(jìn)行western blot，可以檢測(cè)到H5NS2 和PRDX3 之間的結(jié)合，但H5NS2 與EGFP 對(duì)照之間則不能夠相互結(jié)合(圖2)，表明重組表達(dá)的H5NS2 蛋白與PRDX3 蛋白在293T 細(xì)胞中具有特異性的相互作用。

圖1 酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證PRDX3 與NS2 蛋白的相互作用Fig.1 Ineraction between porcine PRDX3 and NS2 protein identified by yeast two-hybrid system

圖2 Co-IP 試驗(yàn)驗(yàn)證H5NS2 和PRDX3 的相互作用Fig.2 H5NS2 interacts with PRDX3 by Co-IP assay

2.4 GST pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證NS2和PRDX3的相互作用 為排除NS2 蛋白與PRDX3 間接相互作用，本研究進(jìn)行了GST pull-down 試驗(yàn)。GST-H5NS2 融合表達(dá)蛋白為誘餌或者作對(duì)照的GST 蛋白與轉(zhuǎn)染pCAGGS-myc-PRDX3 質(zhì)粒的293T 細(xì)胞的細(xì)胞裂解液孵育，進(jìn)行GST pull-down。結(jié)果表明，在各蛋白正常表達(dá)的情況下，GST-H5NS2 樣品中能夠檢測(cè)到PRDX3 而GST 樣品中則未檢測(cè)到PRDX3(圖3)，進(jìn)一步證明了NS2 蛋白與PRDX3 存在特異的，直接的相互作用。

圖3 GST pull-down 試驗(yàn)驗(yàn)證H5NS2 與PRDX3 的相互作用Fig.3 H5NS2 interacts with PRDX3 by GST pull-down assay

3 討論

Y2H 系統(tǒng)作為一種研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)，已被廣泛用于研究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用。該方法避免了蛋白質(zhì)純化過程，可以檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用，而且適用于高通量篩選與目的蛋白相互作用的蛋白[5]。本研究采用NS2 作為“誘餌”蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選含有Calu-3、A549、THP-1 和U251 4 種細(xì)胞cDNA 文庫，證明了與NS2 的相互作用蛋白PRDX3。Co-IP 試驗(yàn)證實(shí)NS2 和PRDX3 在293T 細(xì)胞中存在特異性的相互作用。

PRDX3 是過氧化物氧還酶蛋白家族的一員，主要定位于線粒體，調(diào)控線粒體中細(xì)胞色素c 的釋放[6-7]。PRDX3 可以降低細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫含量，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[8-9]。流感病毒的NS2 蛋白在結(jié)構(gòu)上可以分為對(duì)蛋白酶敏感的氨基端(1～53)和對(duì)蛋白酶具有抵抗性的羧基端(54～121)[10]。在NS2 蛋白的氨基端具有兩個(gè)核輸出信號(hào)，一個(gè)位于aa12～aa21 之間，另外一個(gè)位于aa31～aa40 之間，兩個(gè)核輸出信號(hào)均與CRM1 具有相互作用關(guān)系，介導(dǎo)vRNP 復(fù)合體輸出細(xì)胞核的過程[1]。此外，NS2 蛋白還具有調(diào)控病毒基因組復(fù)制和促進(jìn)病毒包裝釋放方面的重要作用[3-4]。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定了一種新的與流感病毒NS2 相互作用的宿主蛋白PRDX3，不僅拓展了流感病毒與宿主因子的相互作用網(wǎng)絡(luò)，而且為進(jìn)一步探索流感病毒的復(fù)制周期和致病及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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