葉 超，趙 款，郭金潮，姜成剛，常曉博，王淑杰，王同云，彭金美，蔡雪輝，田志軍，安同慶

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001)

豬偽狂犬病(PR)是由PR 病毒(PRV)引起的一種烈性傳染病，該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，隨Bartha-K61 等疫苗以及鑒別診斷方法的應(yīng)用，在歐美一些國(guó)家PRV 已經(jīng)得到凈化。然而從2011 年底開始，我國(guó)多個(gè)省份免疫過Bartha-K61 疫苗的豬場(chǎng)發(fā)生PRV，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

研究表明，PRV 感染相關(guān)基因gC 通過與硫酸乙酰肝素結(jié)合介導(dǎo)病毒入侵[2]；gB、gD、gH 介導(dǎo)膜融合促進(jìn)病毒衣殼和內(nèi)間質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[3]。gE 和gI通過將新生病毒粒子分配到細(xì)胞連接，促進(jìn)病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散。gE、gI 和TK 基因的缺失可以使PRV 的毒力和感染力顯著降低[4-5]。核苷酸還原酶(RR)由RR1 和RR2 兩個(gè)亞基組成，缺失RR 會(huì)降低病毒的生長(zhǎng)速度[6]。PK 為PRV 增殖的非必需基因，但缺失PK 基因后也導(dǎo)致PRV 毒力下降[7]。微衛(wèi)星序列(SSR)在皰疹病毒基因組中廣泛存在，并與病毒的遺傳變異具有緊密聯(lián)系。SSR 是由幾個(gè)1 bp～6 bp 的核苷酸序列作為重復(fù)單元，串聯(lián)重復(fù)形成的一類DNA 序列。以往對(duì)于歐美PRV 株的研究表明，不同PRV 株間的SSR 變異較大[8]。為研究2011 年以來(lái)我國(guó)PRV 流行株的變異情況，本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的流行株HeN1 株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其感染或毒力相關(guān)基因進(jìn)行序列分析，為PR 的有效防制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及細(xì)胞 于2011 年分離自Bartha-K61疫苗免疫過的豬場(chǎng)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀死亡仔豬的PRV HeN1 株及Vero-E6 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 LA Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker 及pMD18-T 載體均購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.3 病毒培養(yǎng)與核酸提取 將HeN1 株接種于Vero-E6 細(xì)胞，待病變率達(dá)到80%時(shí)收獲病毒液。按照常規(guī)方法提取PRV 基因組DNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)合成、病毒基因組分段克隆及測(cè)序參照GenBank 中登錄的Kaplan 全基因序列(KJ717942)設(shè)計(jì)96 對(duì)特異性引物(如讀者需要，作者可以提供相關(guān)的引物序列信息)，以HeN1 株基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，相鄰引物擴(kuò)增區(qū)域保證至少重疊100 bp，引物由博仕生物科技有限公司合成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，由北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。

1.5 PRV感染和毒力相關(guān)基因的比對(duì)分析 將HeN1 株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得全基因組序列，并與GenBank 中登錄的PRV 相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6 PRV序列的進(jìn)化樹分析 參照文獻(xiàn)[9]方法，選取PRV 各病毒株gC 基因部分序列，采用MEGA5.1 軟件根據(jù)neighbor-joining 方法繪制無(wú)根系統(tǒng)發(fā)生樹，比對(duì)值為1 000 次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 PRV HeN1株與參考病毒株的核苷酸同源性分析 PRV HeN1 株(KP098534)全長(zhǎng)141 803 bp，GC含量為73.7 %，UL 區(qū)占70.2 %，US 區(qū)占9.6 %，內(nèi)部重復(fù)區(qū)和末端重復(fù)區(qū)均占11.3 %。HeN1 株與國(guó)外參考病毒株(Kaplan、Bartha 和Becker)全基因組序列同源性為89.9 %～93.3 %，與中國(guó)病毒株TJ(KJ789182)同源性為96.9 %。各基因同源性分析結(jié)果顯示新流行株之間(HeN1、TJ 和BJ/YT)同源性最高，與中國(guó)早期的Fa 株和Ea 株同源性較高，與國(guó)外代表病毒株同源性最低(表1)。

表1 HeN1 株與國(guó)內(nèi)外參考病毒株的基因核苷酸同源性比較Table 1 The identity of different genes between HeN1 and reference isolates

2.2 PRV感染和毒力相關(guān)蛋白的變異特征 國(guó)內(nèi)分離株和國(guó)外分離株間存在一些特有的突變氨基酸，這些突變?cè)趪?guó)內(nèi)外分離株間是高度保守且大量存在的。除TK、RR2 外，其他8 個(gè)蛋白均存在插入或缺失(圖1)。其中RR1、gB、gC、gE、gI 的插入/缺失是國(guó)內(nèi)分離株與國(guó)外分離株間特有的差異，以國(guó)內(nèi)分離株在gC 蛋白連續(xù)插入7 個(gè)氨基酸(63AAASTPA69)最為顯著。RR2、TK、PK、gH 在國(guó)內(nèi)外分離株之間的同源性較高，而表現(xiàn)為較少的特有氨基酸突變。這表明各相關(guān)蛋白在分離株間的保守性存在差異。另外分析顯示在RR1 序列中，歐美分離株在GCC 重復(fù)單元中插入了9 個(gè)堿基形成3 個(gè)絲氨酸的插入。在PK 和gH 的序列中，由于SSR重復(fù)單元(GGCGAC 和GAG)的增加，病毒株Becker分別比其他分離株多編碼了2 個(gè)氨基酸。在gD 序列中，歐洲病毒株Kaplan 和Bartha 由于SSR 重復(fù)單元的減少而缺少了2 個(gè)氨基酸。在gE 序列中存在的兩處天冬氨酸插入現(xiàn)象也是由于SSR 重復(fù)單元(GAC)數(shù)量的變異引起的(圖1)。表明大部分插入/缺失的產(chǎn)生與SSR 的變異相關(guān)。至于這些缺失/插入及突變對(duì)各毒力蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，還有待進(jìn)一步研究。

圖1 PRV 感染和毒力相關(guān)蛋白的缺失/插入?yún)^(qū)域比對(duì)結(jié)果Fig.1 Comparative alignment analysis of PRV proteins

2.3 基于gC基因的PRV遺傳進(jìn)化分析 選取PRV 各病毒株gC 基因部分序列，進(jìn)行進(jìn)化樹分析表明，國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)化具有顯著差異，處于兩個(gè)獨(dú)立的遺傳分支。中國(guó)新分離株在相對(duì)集中的小分支上，親緣關(guān)系緊密。與早期的PRV Fa 株(1964 年分離)在不同的遺傳分支上，但與以往病毒株Ea(1999 年分離)在一個(gè)大的分支中(圖2)。表明新分離株可能是中國(guó)早期的分離株逐漸演變而來(lái)。

3 討論

余秋穎等對(duì)河南省2012 年～2013 年的PRV 流行株gE、TK 和gD 基因進(jìn)行過比對(duì)分析[10]，但目前對(duì)PRV 新流行株的分子特征還知之甚少。本研究進(jìn)一步對(duì)新流行株HeN1 株的感染和毒力相關(guān)基因進(jìn)行了序列分析，并與GenBank 中登錄的國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行比較分析，以研究PRV 新流行株相關(guān)基因的變異情況。結(jié)果表明，以HeN1 為代表的2011 年以來(lái)的流行株具有相似的突變和缺失/插入特征。與國(guó)內(nèi)早期分離株相比，它們之間具有較高的同源性和很近的遺傳關(guān)系，屬于同一個(gè)大的遺傳分支。國(guó)內(nèi)外分離株間卻存在顯著遺傳差異，在進(jìn)化關(guān)系上處在兩個(gè)獨(dú)立的遺傳分支。歐美等國(guó)外分離株與中國(guó)的分離株在各感染和毒力相關(guān)蛋白氨基酸編碼上存在較多特征氨基酸的突變和特異性缺失/插入。最為顯著的是中國(guó)分離株相對(duì)于國(guó)外分離株在gC蛋白第63～69 位連續(xù)插入7 個(gè)氨基酸(AAASTPA)，該插入突變可以進(jìn)一步作為鑒定國(guó)內(nèi)外PRV 的分子特征。另外本研究首次發(fā)現(xiàn)有些缺失/插入與SSR的變異直接相關(guān)，而且是由于SSR 重復(fù)單元數(shù)量的變化造成的。至于這些缺失/插入及突變對(duì)各毒力蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，還有待進(jìn)一步研究。

圖2 基于gC 基因的PRV 進(jìn)化樹分析Fig.2 Evolutionary analysis of PRV based on gC sequences

以上研究表明，2011 年以來(lái)不同地區(qū)分離的PRV 流行株的感染和毒力相關(guān)基因具有相似的缺失/插入分子特征，在進(jìn)化樹上處于單獨(dú)的小分支。我國(guó)早期PRV 與2011 年以來(lái)流行株之間，各感染和毒力相關(guān)基因的同源性較高，二者有很近的親緣關(guān)系。而國(guó)外病毒株與國(guó)內(nèi)病毒株間各相關(guān)基因有較大突變和缺失/插入，二者進(jìn)化關(guān)系很遠(yuǎn)。

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