佟 杰，王 剛，于 穎,3，張 沖,2，常亞飛，劉永剛，涂亞斌，湯艷東，姜成剛，王淑杰，蔡雪輝*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

高致病性豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)是由HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的豬病毒性傳染病。HP-PRRSV 主要感染豬單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，引起仔豬的明顯發(fā)病特征為持續(xù)高熱和免疫抑制，尤其是免疫抑制的出現(xiàn)對(duì)防制該病造成了很大的阻礙[1-2]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染斷奶仔豬可引起胸腺萎縮、胸腺細(xì)胞大量凋亡、外周血CD4+/CD8+顯著下調(diào)[1-3]、外周免疫器官損傷并伴有淋巴細(xì)胞凋亡[4]，同時(shí)伴有大量炎性因子(IL-lβ、IL-6 和TNF-α 等)分泌[2,5]。

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的一類甾體激素，其通過與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的特異性受體結(jié)合形成復(fù)合物來發(fā)揮作用[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染斷奶仔豬7 d 后，外周血中糖皮質(zhì)激素含量顯著升高，并且與促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及外周血淋巴細(xì)胞凋亡具有一定相關(guān)性，但經(jīng)典病毒株感染并無類似變化(待發(fā)表資料)。

地塞米松(DEX)是一種在臨床中應(yīng)用十分廣泛的糖皮質(zhì)激素類似物，具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗過敏及抗休克等作用[6-8]，目前主要應(yīng)用于危重疾病的急救和各類炎癥的治療。本研究通過在不同時(shí)間對(duì)感染HP-PRRSV HuN4 株的斷奶仔豬肌肉注射糖皮質(zhì)激素類似物DEX，分析其對(duì)HP-PRRSV 感染仔豬的發(fā)病影響，為全面研究HP-PRRSV 的致病機(jī)理和臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 HP-PRRSV HuN4 株由本實(shí)驗(yàn)室保存，病毒滴度為1×105TCID50/mL；17 頭30 日齡的PRRSV 抗原、抗體陰性的健康斷奶仔豬購(gòu)自哈爾濱周邊PRRSV 抗原抗體陰性豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑 DEX 磷酸鈉注射液(5 mg/mL)購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥六廠；禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、Ex Taq DNA 聚合酶(Hot Start Version)購(gòu)自TaKaRa 公司；豬白介素 1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α ELISA kit 購(gòu)自Cloud Clone-Corp(USA)公司；Anti-pig CD4-FITC antibody、Anti-pig CD8-R-PE antibody、Anti-pig CD3-SPRD antibody 購(gòu)自Southern Biotech 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 17 頭30 日齡的健康斷奶仔豬隨機(jī)分為5 組，HuN4+DEX(H)組5 頭，HuN4+DEX(L)組3 頭，DEX+HuN4 組2 頭，HuN4 單獨(dú)感染組4頭，空白對(duì)照組3 頭。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。每日觀察臨床癥狀并測(cè)量直腸溫度，并于感染后0、3 d、7 d、10 d 前腔靜脈采血。第14 d 全部迫殺。

表1 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

1.4 外周血病毒載量的檢測(cè) 將新鮮采集的抗凝血按照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。采用熒光定量RT-PCR 方法檢測(cè)外周血中的病毒載量[9]。

1.5 血清中細(xì)胞因子蛋白含量的檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說明書對(duì)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)兩孔，重復(fù)試驗(yàn)兩次。

1.6 外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[3]，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中淋巴細(xì)胞亞群的變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢病變 HuN4+DEX(H)組、HuN4+DEX(L)組及DEX+HuN4 組均在感染后2 d開始呈現(xiàn)40 ℃以上高熱，與HuN4 組相比，體溫?zé)o顯著差異(圖1A)。HuN4+DEX(H)組、HuN4+DEX(L)組及DEX+HuN4 組在感染后14 d 內(nèi)全部死亡(圖1B)，病死豬病理變化明顯：肺臟淤血，肉樣變；胸腺嚴(yán)重萎縮，腹股溝和頜下淋巴結(jié)腫大，部分豬脾臟腫大出現(xiàn)壞死(表2)。HuN4 單獨(dú)感染組眼觀發(fā)病癥狀明顯，DEX 注射組部分實(shí)驗(yàn)豬出現(xiàn)明顯的耳部發(fā)紺癥狀。

表2 實(shí)驗(yàn)豬剖檢病變Table 2 Gross lesions of experimental piglets in all groups

圖1 感染后實(shí)驗(yàn)豬體溫(A)和存活率(B)變化曲線Fig.1 Changes of temperature curve(A)and survival proportion of piglets(B)during HP-PRRSV infection

2.2 外周血中病毒載量 采用熒光定量RT-PCR 檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)豬外周血中病毒載量。結(jié)果顯示，DEX+HuN4 組病毒載量在病毒感染后7 d 達(dá)到107.5拷貝/mL，10 d 達(dá)到109.5拷貝/mL。其他DEX 注射組與HuN4 單獨(dú)感染組相比無明顯變化，空白對(duì)照組未檢測(cè)到病毒(圖2)。

圖2 病毒感染后不同時(shí)間外周血病毒載量Fig.2 Viral RNA loads in peripheral blood of piglets

2.3 外周血中促炎性細(xì)胞因子變化 采用ELISA法對(duì)外周血中促炎性細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，于感染后3 d，HuN4 單獨(dú)感染組外周血中主要的促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白含量開始上升，7 d 明顯升高。DEX 注射組與空白對(duì)照組相比，各炎性因子的蛋白水平均有一定程度上升，但均低于HuN4 單獨(dú)感染組(圖3)。該結(jié)果表明DEX 對(duì)HP-PRRSV 引起的炎性反應(yīng)起到了一定的抑制的作用。

2.4 外周血中淋巴細(xì)胞亞群變化 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血中淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，于感染后7 d，HuN4 單獨(dú)感染組豬外周血中的CD4+CD8-細(xì)胞比例顯著減少，由19.8%減少到6.1%(p<0.05)(圖4A)，而CD4-CD8+細(xì)胞比例顯著增加，由27.6%增加到69.2 %(p<0.05)(圖4B)，CD4+CD8+細(xì)胞比例先減少后增加(圖4C)。DEX 注射組與HuN4 單獨(dú)感染組變化趨勢(shì)相似，但均有所緩和。

圖3 外周血中促炎性細(xì)胞因子水平變化(a,b：不同字母表示差異顯著，p<0.05)Fig.3 Concentration of pro-inflammatory cytokines in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

圖4 外周血內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群比例(a,b：不同字母表示差異顯著，p<0.05)Fig.4 Proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

3 討論

HP-PRRSV 感染會(huì)引起仔豬體溫高熱、胸腺萎縮及淋巴細(xì)胞發(fā)生大量凋亡[10]。病毒感染與機(jī)體的相互作用十分復(fù)雜，通常是以免疫系統(tǒng)為主，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)輔助參與調(diào)節(jié)的過程。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫環(huán)路中，最重要的中心環(huán)節(jié)即為下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)(HPA 軸)[11-12]，其主要的調(diào)控機(jī)制是通過控制以糖皮質(zhì)激素為主的一系列內(nèi)分泌激素的釋放影響細(xì)胞內(nèi)靶基因，如促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的轉(zhuǎn)錄以及NF-kB、MAPK 等信號(hào)通路的激活，從而達(dá)到參與調(diào)節(jié)機(jī)體在病原微生物感染后的免疫功能[12]。

糖皮質(zhì)激素具有一定的免疫抑制作用，可以起到退熱消炎的效果，但有報(bào)道表明，在流感病毒感染的小鼠中，過量的糖皮質(zhì)激素雖然可以部分緩解炎癥反應(yīng)，但卻使病毒的復(fù)制增強(qiáng)，從而加重了病毒載量升高引起的病理損傷[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過采用不同劑量的糖皮質(zhì)激素類似物DEX，觀察其對(duì)HP-PRRSV 感染后的仔豬臨床發(fā)病癥狀和免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞亞群的影響。結(jié)果表明，連續(xù)7 d 使用低劑量糖皮質(zhì)激素，造成了感染仔豬機(jī)體內(nèi)3 種主要的促炎性細(xì)胞因子水平下降，加強(qiáng)了病毒的復(fù)制，從而使病毒感染造成的損傷加重，造成仔豬死亡。但促炎性細(xì)胞因子引起病毒復(fù)制增強(qiáng)的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。另外本實(shí)驗(yàn)對(duì)臨床用藥也具有一定的指導(dǎo)意義，作為臨床中的常用藥，DEX 的使用具有嚴(yán)格限制。本實(shí)驗(yàn)中連續(xù)7 d 低劑量注射DEX 會(huì)造成仔豬機(jī)體免疫抑制，增加其死亡率，因此證實(shí)不當(dāng)使用激素類藥物會(huì)造成病毒感染加重。目前，一些飼料添加劑中由于含有糖皮質(zhì)激素，而引起動(dòng)物感染病毒后病情加重的現(xiàn)象可能也與這一機(jī)制有關(guān)。

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