于桂梅，周微微，祖述龍，王子龍,2，陳 曦，葛金英*，步志高*

(1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，河北 保定 071000)

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的人和動物神經(jīng)系統(tǒng)病變，死亡率高達100 %，為重要的人獸共患病之一[1]。RV 為彈狀病毒科狂犬病毒屬，具有囊膜的單股負鏈RNA 病毒。該病毒主要編碼5 種蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、病毒RNA 聚合酶(L)和一個糖蛋白(G)[2-4]。其中G 蛋白以三聚體的形式錨定于病毒囊膜表面，并能夠與細胞表面的受體結合，介導膜融合使病毒侵入細胞[5]。同時，G 蛋白是RV 主要的抗原蛋白，刺激機體產生中和抗體[6]。

本研究以新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F 蛋白)的跨膜區(qū)(TM)和膜內區(qū)(CT)替換RV G 的相應部分，研究其對G 蛋白在表達G 蛋白的重組NDV(rL-RVGTC)中的表達及相關生物學特性的影響，結果顯示TM 和CT 對RV G 的形成病毒蝕斑及免疫原性是必不可少的。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 表達RV G 蛋白的重組NDV(rL-RVG)、重組NDV 弱毒疫苗株rLaSota(rL)、NDV感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ、輔助核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)、和大聚合酶蛋白(pBS-L)重組質粒、表達GFP 蛋白的NDV 重組病毒和RV 重組病毒均由本實驗室構建；表達T7 聚合酶的重組痘病毒vTF7-3 由Moss 博士惠贈；雞抗NDV、犬抗RV 高免血清均由本實驗室制備[7]；FITC 標記兔抗犬IgG(IgG-FITC)、羊抗雞IgG-TRITC、兔抗雞IgG-HRP 及羊抗兔IgG-HRP 二抗均購自Sigma 公司。SPF 雞胚和SPF 雛雞由本研究所SPF 實驗動物中心提供；SPF 級BALB/c 鼠購自北京維通利華公司。

1.2 表達RVGTC基因的重組感染性克隆的構建為將RV G 的TM 和CT 替換為NDV F 蛋白的TM和CT，人工合成嵌合RVGTC 基因，并在其兩端分別引入轉錄調控啟動子(GS)、終止子(GE)序列及PmeⅠ酶切位點。經(jīng)PmeⅠ酶切處理后插入感染性克隆載體pBRN-FL-PmeⅠ中，構建表達RVGTC 基因的pBRN-FL-RVGTC 感染性克隆。

1.3 重組病毒的拯救及鑒定 參考文獻[7]的方法拯救病毒。提取血凝陽性的雞胚尿囊液總RNA。以RV G 蛋白基因特異性引物進行重組病毒RT-PCR 鑒定，并將拯救的重組病毒命名為rL-RVGTC。

1.4 RVGTC蛋白表達的檢測 分別將MOI 為0.1的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 感染BHK-21 細胞，24 h后以預冷的3%的多聚甲醛室溫固定20 min。分別以犬抗RV(1∶50)和雞抗NDV(1∶100)為一抗，兔抗犬IgG-FITC(1∶100)和羊抗雞IgG-TIRTC(1:100)為二抗，采用0.5 μg/mL 的DAPI 進行細胞核染色。利用激光共聚焦顯微鏡進行間接免疫熒光檢測(IFA)。

將rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 接 種BHK-21 細胞，培養(yǎng)72 h 后刮取細胞裂解處理后，分別以鼠抗β-actin(1∶5 000)、兔抗RV(1∶50)和雞抗NDV(1∶100)為一抗，兔抗雞IgG-HRP(1:2 000)或羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，經(jīng)western blot 進行檢測。

1.5 rL-RVGTC擴散方式的觀察及其滴度的鑒定以rL、rL-RVG 及rL-RVGTC 分別感染BHK-21 細胞，在感染不同時間點分別固定相應細胞進行IFA檢測，觀察重組病毒是否形成蝕斑。同時收集相應時間點的細胞培養(yǎng)上清液，利用9 日齡～11 日齡SPF 雞胚測定其中重組病毒含量(EID50)，對比3 種病毒在細胞培養(yǎng)過程中產生子代病毒能力的變化。

1.6 重組病毒的致病性試驗及病毒的生長曲線對重組病毒rL-RVGTC F3 代進行雞胚平均致死時間(MDT)、腦內致病指數(shù)(ICPI)及靜脈致病指數(shù)(IVPI)等致病性指標測定，檢測RVGTC 蛋白的表達對NDV 致病性的影響。

以劑量為104.375EID50的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC分別接種10 日齡的SPF 雞胚，每12 h 分別收取5個雞胚的尿囊液測定其TCID50，直至108 h，并根據(jù)測定結果繪制生長動力學曲線。

1.7 重組病毒的免疫試驗 24 只6 周齡的BALB/c小鼠隨機平均分成兩組，分別經(jīng)肌肉注射途徑接種5×107EID50的rL-RVG 和rL-RVGTC，于免疫后第3周和第4 周后采血，測定血清中NDV 和RV 的特異性中和抗體，第4 周進行二次加強免疫，二免后間隔兩周(待抗體水平變化平穩(wěn)后延長采血間隔時間到4 周)采血測定兩組小鼠抗體水平變化，比較TM 和CT 的替換對G 蛋白免疫原性的影響。

2 結果

2.1 表達RVGTC基因的重組病毒感染性克隆的構建和重組病毒的拯救 利用人工合成的編碼G 蛋白的TM 和CT 序列替換為NDV F 蛋白相應部分RVGTC 蛋白基因插入NDV 感染性克隆pBRNFL-PmeI 中，構建表達嵌合RVG 蛋白RVGTC 的重組NDV cDNA 克隆pBRN-FL-RVGTC。

將pBRN-FL-RVGTC 與表達NDV NP、P、L 蛋白的輔助質粒共轉染BHK-21 細胞。收獲細胞及上清液接種9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，培養(yǎng)5 d 后收取HA 檢測陽性的尿囊液(含有拯救重組病毒)命名為rL-RVGTC。

2.2 重組病毒的RT-PCR鑒定 提取血凝陽性的尿囊液總RNA，利用RT-PCR 方法擴增出約800 bp的片段(圖1)。序列分析結果顯示，重組病毒基因組的預期位點正確插入了RVGTC 基因及所引入的轉錄調控序列。

圖1 RT-PCR 鑒定重組病毒的RVGTC 基因Fig.1 Identification of recombinant virus of rL-RVGTC by RT-PCR

2.3 RVGTC 蛋白表達的檢測 將rL-RVGTC、rL-RVG 和親本株rL 分別感染BHK-21 細胞，培養(yǎng)24 h 后固定細胞。以雞抗NDV 和犬抗RV 高免血清為一抗，羊抗雞IgG-TIRTC 和兔抗犬IgG-FITC 為二抗，DAPI 進行細胞核染色制備共聚焦樣品。結果顯示以抗NDV 高免血清為一抗，3 株病毒感染的細胞均為陽性，而以犬抗RV 高免血清為一抗，只有rL-RVG 和rL-RVGTC 感染的細胞為陽性。這表明rL 感染的細胞內只有NDV 蛋白表達，而在rL-RVG和rL-RVGTC 感染的細胞內既有NDV 蛋白又有RV G 蛋白的表達(圖2)。

分別將rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 感染BHK-21細胞72 h 后，刮取細胞裂解處理后以鼠抗β-actin，雞抗NDV 和兔抗RV 高免血清為一抗，兔抗雞和羊抗兔IgG-HRP 為二抗，經(jīng)western blot 分析。并通過測定蛋白濃度確定rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 相同的上樣量，結果顯示rL 感染細胞蛋白樣品只檢查到一條NDV 特異性條帶，而rL-RVG 和rL-RVGTC 感染細胞的蛋白樣品能夠同時檢測到NDV 和RVGTC兩條特異性條帶，并且rL-RVG 和rL-RVGTC G 蛋白在細胞中的表達量無明顯的區(qū)別(圖3)。

圖2 激光共聚焦觀察RVGTC 蛋白在重組病毒感染細胞內的表達Fig.2 Immunofluorescence analysis of RVGTC protein expression and subcellular localization examed by LSM

圖3 RVGTC 在BHK-21 細胞中表達的western blot 檢測Fig.3 Analysis of RVGTC protein expression by western blot

2.4 rL-RVGTC蝕斑形成能力檢測 rL、rL-RVG和rL-RVGTC 分別感染BHK-21 細胞，在感染后特定的時間點固定細胞進行IFA 觀察其在細胞上的擴散形式。結果表明，rL-RVG 能夠從最初感染的細胞擴散到臨近細胞，形成病毒蝕斑，而rL-RVGTC與rL 的擴散方式相同，從感染后24 h 到84 h，細胞的感染密度未發(fā)生明顯改變(圖4)。

rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 分別感染BHK-21 細胞，在特定的時間點收集感染細胞上清液經(jīng)雞胚測定其EID50，測定對比3 種病毒后代的毒力。結果顯示，不同時間點上清液rL、rL-RVG 和rL-RVGTC的EID50無明顯差異。rL-RVGTC 的滴度在感染后72 h 達到峰值，其病毒滴度與rL 相似，但1/5 log低于rL-RVG(圖5)。將一部分上清液在細胞中進行病毒滴定，發(fā)現(xiàn)其不能感染細胞。表明RVGTC 沒有改變rL-RVGTC 子代病毒的擴散能力。

圖4 rL-RVGTC 病毒蝕斑形成的觀察Fig.4 Observation of the ability of rL-RVGTC to form virus plaque

圖5 重組病毒在感染BHK-21 細胞上清液的病毒滴度Fig.5 Titer of recombinant viruses in the supernatant of infected BHK-21 cells

2.5 重組病毒的致病性分析 重組病毒株rLRVGTC F3 代 的EID50為108.375/0.1 mL；MDT 大 于120 h，ICPI 和IVPI 均為0，該結果表明重組弱毒苗保持了rL 親本疫苗株對雞胚的高滴度生長適應和低致病的特性。

以104.375EID50的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 分別接種10 日齡的SPF 雞胚，每12 h 分別收取5 個雞胚的尿囊液測定其TCID50。各個時間點rL、rL-RVG和rL-RVGTC 生長滴度沒有明顯的差異，rL-RVGTC與rL 和rL-RVG 具有相似的生長動力學曲線和相似的病毒滴度。

2.6 rL-RVG與rL-RVGTC在誘導抗體水平的比較通過免疫小鼠血清檢測，其中和抗體水平在一免和二免后，rL-RVG 和rL-RVGTC 誘導的相同水平的NDV 中和抗體。然而，rL-RVG 誘導的RV 抗體水平顯著高于rL-RVGTC。一免后，免疫rL-RVG 的一組小鼠83.3 %以上中和抗體達到到有效提供免疫保護水平，而免疫rL-RVGTC 的一組小鼠只有33.3 %的小鼠的中和抗體達到免疫保護水平(圖6)。

圖6 rL-RVG 和rL-RVGTC 在小鼠體內誘導產生的病毒中和抗體水平Fig.6 VNA levels induced by recombinant viruses

3 討論

本實驗室前期構建了表達RV G 的重組新城疫病毒rL-RVG，結果表明在G 蛋白的作用下，rL-RVG 能夠從感染細胞擴散到周圍細胞，形成明顯的病毒蝕斑[8]。同時，rL-RVG 能在小鼠體內引發(fā)針對RV 的劑量依賴性的有效的持久的保護[8]。此外，PV 株和CVS 株的RV G 蛋白替換其TM 和CT后只能以單聚體的形式存在，免疫原性下降[9]。

為研究TM 和CT 對ERA 株RV G 蛋白表達，病毒蝕斑形成和免疫原性的影響。在本研究中，我們將RV G 蛋白的TM 和CT 用NDV F 蛋白的相應部分進行替換，將嵌合RV G 蛋白插入到NDV 載體拯救病毒后進行檢測。IFA 和western blot 結果顯示RV G 和RVGTC 在BHK-21 細胞水平上表達量沒有顯著差異，表明TM 和CT 的替換對RVG 自身的表達影響不大。但TM 和CT 的替換改變了G 蛋白的融合能力，使rL-RVGTC 病毒失去了在BHK-21 細胞上形成病毒蝕斑的能力。這與文獻中報道的RV G 替換TM 和CT 后以單體的形式存在，不能發(fā)生相應構象的變化的結果是一致的[9]。這進一步證明了RVG TM 和CT 對其三聚體的形成以及其擴散作用是必需的。

TM 和CT 的替換對rL-RVGTC 生長動力學幾乎沒有影響，無論是在雞胚還是在細胞上的復制均無明顯改變，但其免疫原性明顯下降，這有可能是因為RVGTC TM 和CT 的替換影響了其膜外區(qū)的折疊[9]，從而使有效的抗原表位減少。證明TM 和CT 對RV G 有效的免疫原性有重要作用。

[1]Dietzschold B,Schnell M,Koprowski H.Pathogenesis of rabies[J].CTMI,2005,292:45-56.

[2]Faber M,Li Jong-ming,Kean R B,et al.Effective preexposure and postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus[J].PNAS USA,2009,106:11300-11305.

[3]Dietzschold B,Wunner W H,Wiktor T J,et al.Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus[J].PNAS USA,1983,80:70-74.

[4]Dietzschold B,Wang H H,Rupprecht C E,et al.Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein[J].PNAS USA,1987,84:9165-9169.

[5]Jayakar H R,Jeetendra E,Whitt M A.Rhabdovirus assembly and budding[J].Virus Res,2004,106:117-132.

[6]Wiktor T J,Macfarlan R I,Reagan K J,et al.Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene[J].PNAS USA,1984,81:7194-7198.

[7]馮秋霖，劉茂軍，祁芳，等.表達雞支原體TM1 蛋白基因重組新城疫病毒的構建及其免疫原性研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35(10)：779-782.

[8]Ge Jin-ying,Wang Xi-jun,Tao Li-hong,et al.Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe,highly immunogenic,and provides long-lasting protection in dogs and cats[J].J Virol,2011,85:8241-8252.

[9]Gaudin Y,Moreira S,Benejean J,et al.Soluble ectodomain of rabies virus glycoprotein expressed in eukaryotic cells folds in a monomeric conformation that is antigenically distinct from the native state of the complete,membrane-anchored glycoprotein[J].J Gen Virol,1999,80(7):1647-1656.