毛雯靜 張煥康 沈波 何培杰

·基礎(chǔ)研究·

活性氧生成在卡鉑誘導(dǎo)HN-3人喉鱗癌細胞凋亡中的作用△

毛雯靜 張煥康 沈波＊何培杰

目的觀察卡鉑(carboplatin)對HN-3人喉鱗癌細胞體外增殖的抑制作用、凋亡誘導(dǎo)，探討活性氧生成在其中的作用。方法用卡鉑以不同孵育濃度、不同孵育時間處理HN-3細胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞活力，2′，7′二氯氫化熒光素已二脂(H2DCFDA)染色測定活性氧生成，Hoechst/PI雙重染色檢測細胞凋亡/壞死情況，蛋白印跡法(Western blotting)測定多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)表達。結(jié)果卡鉑對體外培養(yǎng)的HN-3細胞有增殖抑制作用，呈劑量依賴性和時間依賴性；卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞活性氧生成及凋亡呈時間與劑量依賴性；卡鉑誘導(dǎo)氧化壓力下PARP表達上調(diào)。結(jié)論卡鉑可抑制人喉鱗癌HN-3細胞增殖，誘導(dǎo)HN-3細胞凋亡，其機制可能與卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞活性氧生成及氧化壓力下PARP表達上調(diào)有關(guān)。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：384-387)

喉鱗癌；卡鉑； 活性氧；凋亡；多聚ADP-核糖聚合酶

目前喉癌的治療提倡以手術(shù)為主，輔以放化療的綜合治療。近年來，誘導(dǎo)化療、同步放化療、序貫化療、增效化療等的提出與應(yīng)用，在一定程度上提高了喉癌患者的生存率與治療后的生存質(zhì)量。卡鉑是第2代鉑類化合物, 其抗癌活性與順鉑相似, 但毒性明顯低于順鉑[1]。本實驗以體外培養(yǎng)的HN-3細胞為對象, 觀察卡鉑對HN-3細胞增殖和凋亡的影響，探討卡鉑在喉癌治療中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)方法 AMC-HN-3細胞(韓國Asan Medical Center贈送)由1例先前未經(jīng)任何治療的63歲男性喉鱗癌患者標本分離純化而來[2]，培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清混合100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone 公司,美國)。恒溫箱培養(yǎng)條件為飽和濕度，5% CO2，95%空氣，37 ℃。0.25%胰酶-0.01%乙二胺四乙酸(EDTA) 消化傳代細胞。

1.2 四甲基偶氮唑鹽實驗 細胞增殖活力由四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)實驗進行評價。按規(guī)定的時間處理標本后，50 μL MTT 液體 (2 mg/mL) 加入96孔板培養(yǎng)孔孵育2 h后，將MTT液更換為100 μL 二巰基琥珀酸(DMSO)。經(jīng)20 s振蕩后，測量540 nm波長吸光度，細胞活力百分比按下述公式進行計算：細胞活力(%)=治療組平均吸光度/對照組平均吸光度×100%。

1.3 激光共聚焦顯微鏡 活性氧(reactive oxygen series, ROS)生成通過2′，7′二氯氫化熒光素已二脂(H2DCFDA) (D399，Molecular Probes 公司，美國)染色進行評價。簡要步驟包括：標本經(jīng)卡鉑處理達到要求的時間點后，以2 μmmol/L H2DCFDA在37 ℃下孵育細胞30 min；之后以磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗細胞，激光共聚焦顯微鏡采集熒光圖片。細胞核形態(tài)通過Hoechst (33342) /PI (Sigma公司,美國)雙重染色進行評價。簡要步驟[3]為：經(jīng)卡鉑處理完畢的標本以2 μg/mL Hoechst (33342)孵育30 min，培養(yǎng)液更換后再以2 μg/mL PI孵育10 min。激光共聚焦顯微鏡觀察標本，拍照。1.4 蛋白印跡實驗 光動力療法治療24 h后，抽提細胞總蛋白，-20 ℃保存。調(diào)整各組總蛋白濃度使每孔上樣量一致(100 μg), 10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜。經(jīng)過脫脂奶粉封閉和洗膜后，分別加入目的抗體，4 ℃過夜。然后按照1∶2 000稀釋濃度加入兔抗過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫標記1 h, 最后進行顯影、水洗、定影后觀察結(jié)果[GAPDH 購于英國Abcam公司，多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)購于美國SantaCruz 公司]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(SD)表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間率的比較采用方差分析檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卡鉑對HN-3細胞增殖的影響 隨著卡鉑濃度的增加，標本540 nm波長吸光度下降(圖1A)，細胞活力相應(yīng)下降，增殖活力降低。0.04～2.50 mg/mL 卡鉑孵育下，HN-3細胞活力與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)(圖1B)。以0.08 mg/mL 卡鉑孵育HN-3細胞，孵育1 h細胞活力無明顯變化(P=0.136)，孵育3 h后隨著時間的延長，細胞增殖活力逐漸下降。0.08 mg/mL 卡鉑孵育3～48 h，HN-3細胞活力與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)(圖2)。

2.2 卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞ROS生成 熒光標記染料H2DCFDA本身不發(fā)熒光，經(jīng)過ROS氧化可轉(zhuǎn)換成有綠色熒光的DCFDA[4]。因此，H2DCFDA染色可間接體現(xiàn)ROS生成的強弱。經(jīng)過24 h孵育，隨著卡鉑濃度的增加(從0.08 mg/mL至0.63 mg/mL)，DCFDA熒光逐漸增強，提示HN-3細胞生成的ROS逐漸增多(圖3)。0.08 mg/mL卡鉑孵育HN-3細胞3、6、12、24、36、48 h，DCFDA熒光逐漸增強，表明隨著孵育時間延長，HN-3細胞生成的ROS逐漸增多(圖4)。

圖1. 不同濃度卡鉑對HN-3細胞增殖的影響 **示0.04～2.50 mg/mL卡鉑與對照組比較，P<0.01。本實驗重復(fù)3次

圖2. 0.08 mg/ml卡鉑在不同孵育時間對HN-3增殖的影響 **示0.08 mg/mL卡鉑孵育1～48 h，與對照組比較，P<0.01。本實驗重復(fù)3次

圖3. 不同劑量卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞ROS生成與細胞凋亡(×100)

圖4. 0.08 mg/mL卡鉑孵育HN-3 細胞不同時間后ROS生成及凋亡誘導(dǎo)(×100)

2.3 卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞凋亡 Hoechst 33342是一種嗜核酸熒光染料。正常細胞經(jīng)Hoechst染色表現(xiàn)為藍色類圓形細胞核，而凋亡細胞則表現(xiàn)為皺縮、濃染、有時碎裂的亮藍色細胞核。熒光染料PI不能透過完整的細胞膜，因此正常細胞和早期凋亡細胞不會染色。對于晚期凋亡細胞和壞死細胞，PI可將細胞核染成紫紅色。晚期凋亡細胞表現(xiàn)為紫色、亮藍雙染的濃縮、碎裂細胞核；壞死細胞則表現(xiàn)為紫色、藍色雙染的類圓形細胞核。

與ROS生成規(guī)律一致，Hoechst33342/PI雙重染色顯示，經(jīng)過24 h孵育，0.08～0.63 mg/mL卡鉑處理的HN-3細胞隨著卡鉑濃度的增加，凋亡細胞的比例逐漸增加，凋亡細胞表現(xiàn)為Hoechst33342/PI核皺縮、濃染、碎裂(圖3)。0.08 mg/ml卡鉑孵育HN-3細胞3、6、12、24、36、48 h，HN-3細胞凋亡比例逐漸增多，呈時間依賴性(圖4)。

研究表明,PARP裂解在凋亡誘導(dǎo)過程中發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。蛋白印跡實驗顯示，隨著卡鉑孵育時間的延長，PARP裂解量逐漸增加，呈現(xiàn)出凋亡誘導(dǎo)的時間依賴性特點(圖5)。圖6顯示，0.08 mg/mL較0.04 mg/mL卡鉑孵育HN-3細胞誘導(dǎo)PARP表達量明顯增加。以抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)共同孵育HN-3細胞，PARP裂解量顯著減少，顯示出ROS生成在卡鉑誘導(dǎo)PARP表達中的重要作用。

圖5. 在不同時間點0.08 mg/mL卡鉑孵育HN-3 細胞PARP表達

圖6. 抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)對卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞PARP表達的影響

3 討論

卡鉑是一種類烷化劑的抗腫瘤藥物, 其作用的分子機制為引起DNA 鏈間及鏈內(nèi)交聯(lián), 破壞DNA 而抑制腫瘤的生長[5]。本研究結(jié)果顯示，卡鉑能夠顯著抑制HN-3細胞增殖活性，誘導(dǎo)其凋亡，呈劑量與時間依賴性。隨著卡鉑孵育時間延長，以及孵育濃度的增加，HN-3細胞生成的ROS也逐漸增多。因此我們提出，卡鉑誘導(dǎo)的ROS生成可能在其誘導(dǎo)HN-3細胞凋亡及增殖抑制上發(fā)揮重要作用。

由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成的ROS是細胞代謝的副產(chǎn)品，主要來源是線粒體和質(zhì)膜。在生理情況下，少量的ROS 作為信號分子參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞活動；在病理情況下，過量、持續(xù)的ROS 產(chǎn)生造成細胞嚴重的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致?lián)p傷性后果。ROS 水平對細胞生死有著復(fù)雜的影響，由此對腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性病變等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生和進程帶來復(fù)雜的影響，其中機制尚未完全闡明[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的腫瘤細胞均有一個共同點，即細胞內(nèi)抗氧化酶活性較正常細胞低，對ROS的清除效率低。因此提高腫瘤細胞內(nèi)的ROS含量，無疑有利于對腫瘤細胞的損傷和抑制[7]。本研究結(jié)果顯示，卡鉑處理后能增加喉癌HN-3細胞內(nèi)ROS的生成釋放，呈劑量與時間依賴性特點。我們以GSH與卡鉑同時孵育HN-3細胞，應(yīng)用抗氧化劑抑制ROS生成，結(jié)果顯示，較卡鉑單純孵育組，同時孵育GSH組PARP裂解量明顯減少，表明ROS生成在卡鉑誘導(dǎo)HN-3細胞凋亡過程中發(fā)揮決定性作用。

我們先前的研究表明，誘導(dǎo)大量的ROS產(chǎn)生是光動力療法的主要機制之一[8]。因此，聯(lián)合卡鉑和PDT可能提高腫瘤細胞內(nèi)的ROS生成，進而有利于殺傷腫瘤細胞。我們曾嘗試卡鉑和PDT聯(lián)合治療HN-3細胞，結(jié)果提示，聯(lián)合治療組較單一治療組有協(xié)同的細胞毒性殺傷效果和凋亡誘導(dǎo)[3]，從而提出，卡鉑可能是通過增加PDT的ROS生成途徑增強其光化學(xué)毒性及凋亡誘導(dǎo)。本實驗結(jié)果進一步支持了這一假說。聯(lián)合治療后能否協(xié)同產(chǎn)生ROS，調(diào)控ROS生成后細胞毒性殺傷效果和凋亡誘導(dǎo)能否隨之改變，以及具體參與的凋亡信號傳導(dǎo)通路均需進一步的實驗證實。

同為鉑類化療藥，卡鉑較順鉑的腎毒性更低，對一些腫瘤的療效更好，但其治療過程中存在固有的或獲得性的耐藥以及其他藥物不良反應(yīng)。有學(xué)者將卡鉑與其他化療藥或PDT等其他治療方式聯(lián)合應(yīng)用[3, 9-10]，為進一步提高療效、降低藥物不良反應(yīng)做了有益的嘗試，其中的機制值得深入研究。

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(本文編輯 楊美琴)

Role of reactive oxygen series generation in the apoptosis of HN-3 human laryngeal carcinoma cells induced by carboplatin

MAOWen-jing,ZHANGHuan-kang,SHENBo＊,HEPei-jie.

DepartmentofOtolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

HE Pei-jie， E mail: hepj2002@sina.com

Objective To investigate the role of reactive oxygen series (ROS) in suppressing cell viability and inducing apoptosis of HN-3 human laryngeal squamous carcinoma cells induced by carboplatin. Methods The attached HN-3 cancer cells were treated with different concentrations of carboplatin for 24 h and 0.08 mg/mL carboplatin at indicated time points. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to detect cellular viability. H2DCFDA staining and Hoechst 33343/PI double staining were performed to monitor reactive oxygen series (ROS) generation and apoptosis/necrosis, respectively. Western blotting technique was used to assess the expression of poly ADP-ribose polymerase(PARP). Results Suppression of cellular viability on HN-3 cells induced by carboplatin was exhibited in a dose and time related pattern. Remarkable generation of ROS and apoptosis of HN-3 cells were initiated by carboplatin in dose and time related manner. Up-regulated expression of PARP under oxidative stress, induced by carboplatin, was partially inhibited by co-incubated with glutathione. Conclusions Generation of ROS and up-regulated PARP may play an important role in the suppression of cellular viability and apoptosis induction of HN-3 cells exerted by carboplatin. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:384-387)

Laryngeal squamous cell carcinoma; Carboplatin; Reactive oxygen series; Apoptosis; Poly ADP-ribose polymerase

國家自然科學(xué)基金面上項目(81172557)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(第45批)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031；＊復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032

何培杰(Email：hepj2002@sina.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.002

2015-04-02)